治疗用微生物专利检索-···牛痘病毒或天花专利检索-专利检索网 (2023)

相关应用

此应用程序是 Be American 应用程序的续集。 #10/872,156，致 Aladar A. Szalay；塔蒂亚娜蒂米里亚索娃；于勇; Qian Zhang，2004 年 6 月 18 日提交，标题为“MICROORGANISMS FOR THERAPY”。该命令的主题通过引用整体并入。

本申请还与 2004 年 6 月 18 日提交的题为“MICROORGANISMS FOR TUMOR THERAPY”的国际申请序列号 PCT/US04/19866 相关。本申请还与 2004 年 6 月 10 日提交的题为“用于肿瘤诊断和治疗的微生物和发光细胞”的美国序列号 10/866,606 相关，该申请是美国序列号 10 的延续/189,918，2002 年 7 月 3 日提交，题为“用于肿瘤治疗的发光微生物”；美国申请序列号 10/849,664，于 2004 年 5 月 19 日提交，标题为“用于诊断和治疗与受伤或发炎组织相关的疾病的微生物和发光细胞”，它是美国序列号 10 的延续/163,763，2002 年 6 月 5 日提交，题为“用于诊断和治疗与受伤或发炎组织相关的疾病的微生物和发光细胞”； PCT 国际申请 WO 03/014380，2002 年 7 月 31 日提交，题为“用于肿瘤诊断和治疗的发光细胞和微生物”； PCT 申请 WO 03/104485，于 2003 年 6 月 5 日提交，标题为“Light Emitting Cells and Microorganisms for Diagnosis and Therapy of Diseases Associated with Injured or Inflamed Tissues”； 2001 年 7 月 31 日提交的欧洲专利申请号 01118417.3，题为“用于肿瘤诊断和治疗的微生物和发光细胞”； 2001 年 10 月 30 日提交的题为“Microorganisms and Light Emitting Cells for Tumor Diagnosis and Therapy”的 EP 申请号 01125911.6；欧洲专利申请号 02 0794 632.6，2002 年 7 月 31 日提交，名称为“Microorganisms and Cells for Tumor Diagnosis and Therapy”；和 EP 订单号02012552.2，2002 年 6 月 5 日提交，标题为“Light Emitting Cells and Microorganisms for the Diagnosis and Therapy of Diseases Associated with Inflamed or Damaged Tissues”。每个命令的主题均通过引用整体并入。

发明领域

提供了含有减毒或修饰微生物（包括微生物和细胞）的疫苗，以及制备微生物和疫苗的方法。特别地，提供了修饰的细菌、真核细胞和病毒，并且提供了使用它们来治疗增殖性和炎性疾病以及在肿瘤中制造产品的方法。

以下

19 世纪末，曾多次尝试用微生物治疗癌症患者。外科医生威廉·科利 (William Coley) 进行了现场管理化脓性链球菌对于成功率有限的肿瘤患者。 20 世纪初，科学家记录了小鼠的牛痘病毒溶瘤作用，导致 1940 年代和 60 年代对肿瘤患者使用各种活病毒。

从那时起，已经测试了几种转基因病毒来治疗癌症。例如，在一项研究中，对携带非转移性结肠腺癌细胞的裸鼠常规注射一种修饰的痘苗病毒 WR 株，该株缺失痘苗生长因子并插入增强的绿色荧光基因座蛋白胸苷激酶。尽管修饰病毒中缺乏外源性治疗基因，但该病毒已被证明具有抗肿瘤作用，包括完全缓解（McCart 等人 (2001)）。水库克雷布斯1:8751-8757)。在另一项研究中，在 III 期临床试验中，将痘苗黑色素瘤溶瘤物 (VMO) 注射到黑色素瘤患者黑色素瘤阳性淋巴结附近的部位。作为对照，给黑色素瘤患者施用纽约市卫生委员会的痘苗病毒 (VV) 株。用 VMO 治疗的黑色素瘤患者比未治疗的患者有更好的存活率，但与用 VV 控制治疗的患者相似（Kim 等人（2001））。肿瘤外科10:53-59）。

其他研究显示这种方法的成功有限。这种疗法并非完全有效，尤其是对于全身给药的病毒或细菌。体内微生物载体功能控制的局限性导致无效的治疗结果并引起安全问题。改进这种类型的疗法或开发更有效的治疗肿瘤疾病的方法将是可取的。因此，这里的目的之一是提供治疗肿瘤和其他疾病的治疗方法和微生物。

概括

本文提供治疗方法和微生物，包括病毒、细菌和真核细胞，用于治疗肿瘤和其他疾病的方法。待治疗的疾病是那些目标组织和/或细胞具有免疫特权的疾病，因为它们以及通常是它们的局部环境以某种方式逃避或无法进入免疫系统。这些组织包括肿瘤和涉及其他增殖性疾病的其他组织和细胞、伤口和涉及炎症反应的其他组织。选择或修饰包括细菌细胞、病毒和哺乳动物细胞在内的微生物，使其不致病并优先在免疫豁免组织中积累。微生物一旦在组织或细胞上或附近，就会影响这些组织中细胞的细胞膜，使它们变得可渗透或裂解，但速度足够慢，以至于靶细胞和肿瘤获得足够的抗原，或者其他蛋白质可以逃脱足够长的时间来触发免疫反应.

微生物通过任何途径施用，包括全身施用，例如B IV 或使用口服或鼻腔或其他将药物导入淋巴管的给药系统。在示例性方法中，微生物用于治疗肿瘤并预防转移的复发和扩散。微生物的例子包括高度减毒的病毒和细菌，以及哺乳动物细胞。任选地修饰微生物以将其他产物(包括其他治疗剂)递送至靶组织。

当微生物被施用于含有肿瘤的宿主时，肿瘤基本上变成了宿主中的抗原和蛋白质工厂。可以利用这一点，使肿瘤可用于制造蛋白质或由微生物编码或产生的其他细胞产物。此外，可以收集宿主血清以分离针对微生物和肿瘤细胞产生的产物的抗体。因此，还提供了通过将微生物施用于动物，通常是非人类动物，并收获肿瘤以分离产物来产生基因产物的方法。还提供了通过向宿主（通常是非人类宿主）施用表达或产生蛋白质或其他产物的微生物来产生针对选定的细胞蛋白质或产物（例如代谢物或中间体）的抗体的方法；从宿主中收集血清并分离出特异性结合蛋白质或其他产物的抗体。

因此，提供了用于杀死免疫豁免细胞或组织，特别是肿瘤的方法和微生物。该方法包括施用，通常是全身施用，微生物优先在免疫豁免细胞（例如肿瘤细胞）中积累，引起蛋白质和其他化合物（例如肿瘤抗原）的渗漏，从而导致宿主接种针对非宿主蛋白质和，例如肿瘤抗原，通过宿主的免疫系统消除免疫豁免细胞，例如肿瘤细胞。选择微生物不是因为它们具有快速裂解细胞的能力，而是因为它们能够在免疫豁免细胞（例如肿瘤）中积累，从而导致足够数量和时间的抗原释放以引发免疫反应。

因此，提供了含有异源DNA、多肽或RNA的微生物或细胞用于诱导生物体针对肿瘤的自身免疫的用途。特别地，选择或修饰微生物以在肿瘤中积累并且在非肿瘤细胞、组织或器官中积累很少，如果有的话（以免对宿主有毒），并以某种方式导致裂解肿瘤细胞或细胞膜的破坏，使肿瘤抗原可以逃逸。这种微生物的实例是LIVP衍生的痘苗病毒和本文所述的细菌，以及已经被修饰以攻击肿瘤和破坏细胞膜的哺乳动物细胞。可以修饰微生物以表达介导或增强抗原从肿瘤细胞流出和/或具有治疗作用的异源产物，例如抗肿瘤化合物。

还提供了产生抗肿瘤抗体的方法（a）通过将含有编码所需多肽或 RNA 的 DNA 序列的微生物或细胞注射到携带肿瘤的生物体中和（b）分离抗肿瘤抗体。

提供了减毒的微生物，其在免疫豁免组织和细胞如肿瘤细胞中积累，但在非靶器官和组织中不积累到毒性水平，并且在给予具有免疫豁免组织和细胞的动物后导致自身免疫。通过产生针对免疫豁免细胞或其产物的抗肿瘤抗体（或抗肿瘤抗原）。选择或修饰微生物以使免疫豁免细胞可渗透，例如，通过缓慢裂解或细胞凋亡过程。我们的目标是实现这种逃逸，但不是快速裂解细胞以致宿主无法产生免疫反应。

提供了使用微生物杀死免疫豁免细胞和组织的用途和方法。微生物任选地包括报道基因和/或改变微生物中基因的其他异源核酸，并且还可以编码和分泌治疗剂或RNA样产物，包括RNAi，改变细胞或组织中基因和/或蛋白质的表达。微生物在其中聚集。在所提供的病毒中，有减毒的痘病毒，其含有修饰的 TK 和 HA 基因以及修饰的 F3 基因或对应于牛痘中 F3 基因的基因座。特别地，提供了重组痘苗病毒，其包含修饰的TK和HA基因和任选的修饰的F3基因或基因座，其中所得病毒不会在非靶器官中积累至毒性水平。提供了其中TK基因和F3基因被修饰的痘苗病毒和HA和F3基因被修饰的痘苗病毒以及所有三个基因都被修饰的病毒。修饰包括通过插入、缺失或取代一个或多个改变病毒产物或活性的核苷酸碱基而失活。改变包括插入异源核酸，例如编码治疗性蛋白质的核酸。

在示例性实施方案中，痘苗病毒是李斯特病毒株，特别是 LIVP 病毒株（LIVP 是指俄罗斯莫斯科病毒制备研究所的李斯特病毒，是这种现在广泛传播的病毒株的原始来源）。修改包括在工程 F3 基因座的独特 NotI 基因座处修改病毒。特别地，修饰可以在F3基因座(基因)的位置35或在痘苗病毒DNA株LIVP的HindIII F片段内的位置1475。

异源核酸可包含可操作地连接至编码蛋白质的核酸的调节序列。调控序列包括启动子，例如痘苗病毒 p7.5 早期/晚期启动子和痘苗病毒 pE/L 早期/晚期启动子。微生物中的异源核酸可以编码能够诱导可检测信号的可检测蛋白质或产物。包含可检测的蛋白质或能够产生可检测信号的产物使得可以监测施用的微生物的分布以及治疗效果，因为当免疫豁免细胞被消除时微生物也被消除。

提供含有重组病毒的宿主细胞，例如本文例举的三重突变痘苗病毒。还考虑了含有本文提供的或方法中使用的任何微生物的肿瘤细胞。

提供在可药用载体中含有微生物的药物组合物用于本文所述的方法。药物组合物可以配制用于任何给药方式，包括但不限于全身给药，例如静脉内给药或配制。组合物可以包含与微生物结合的递送载体，例如基于脂质的载体，包括脂质体和胶束。

还提供了通过向动物施用药物组合物来杀死动物中的免疫豁免细胞例如肿瘤细胞的方法（和微生物的用途），由此病毒在免疫豁免细胞中积累，从而介导感染，驱动自身免疫。消除铅电池或减少其数量。

通过向动物施用微生物来消除动物免疫豁免细胞或组织的治疗方法，其中微生物在免疫豁免细胞中积累；该微生物不会在未受影响的器官和组织中积累，对动物的毒性低；并且微生物导致细胞膜渗漏到免疫豁免细胞中，从而产生针对细胞的自身抗体或向动物提供细胞产物。这些方法包括肿瘤的治疗、包括伤口在内的炎性病症的治疗，以及包括牛皮癣、癌症、糖尿病性视网膜病、再狭窄和其他类似病症在内的增生性病症的治疗。希望微生物不会在未受影响的器官中积累，尤其是卵巢或睾丸。

减毒微生物包括减毒病毒如痘病毒和其他细胞质病毒、细菌如弧菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌米李斯特菌哺乳动物细胞，例如免疫细胞，包括 B 细胞和淋巴细胞，例如 T 细胞和干细胞。

还提供了用于生产多肽或 RNA 或化合物（例如细胞产物）的方法，并因此提供了微生物的用途。此类方法可包括以下步骤： (a) 向携带肿瘤的动物施用含有编码多肽或 RNA 的核酸的微生物，或产生产物化合物，其中微生物在免疫豁免细胞中积累；微生物不会在不包括免疫豁免细胞或组织的器官和组织中积累到毒性水平； (b) 从动物身上获取肿瘤组织； (c) 从肿瘤中分离多肽或 RNA 或化合物。

如所指出的，微生物包括真核细胞、原核细胞和病毒例如E.B.、细胞质病毒或减毒细菌、或干细胞或免疫细胞。细菌可以选自减毒的那些。弧菌、大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌米链球菌形变。微生物可以表达或产生可检测的产物，例如荧光蛋白（即绿色、红色和蓝色荧光蛋白及其修饰的变体）和/或荧光素酶，其在与荧光素接触时产生光并且还可以编码额外的产物，作为资源。在本文提供的方法和用途中，动物可以是非人类动物或可以包括人类。

还提供了同时产生细胞多肽、RNA分子或化合物以及与该多肽、RNA分子或化合物特异性反应的抗体的方法：a)将微生物施用于荷瘤动物，其中微生物表达或产生化合物、多肽或 RNA 分子； b) 从动物血清中分离抗体。可选地，在步骤a)之后，该方法包括从动物身上获取肿瘤组织；从肿瘤组织中分离多肽、RNA 分子或细胞化合物。

还提供了用于杀死动物体内免疫豁免细胞或组织（例如肿瘤细胞）的方法，以及微生物的用途，因此，通过施用至少两种微生物，其中同时、顺序或间歇施用微生物。在免疫豁免细胞中积累，从而使动物针对免疫豁免细胞或组织进行自身免疫。

提供了至少两种微生物用于配制药物以杀死免疫豁免细胞或组织的药物的用途，其中它们在免疫豁免细胞中积聚，从而使动物针对免疫豁免细胞或组织进行自身免疫。提供了包含至少两种微生物的组合，其被配制用于施用于动物以杀死免疫豁免细胞或组织。包含可选包装组合的试剂盒随给药说明和其他试剂一起提供。

异源核酸编码微生物诱导针对免疫豁免细胞中产生的产物的自身免疫的用途，其中在施用后微生物在免疫豁免组织中积累并且不在其他组织或器官中积累，或者积累的水平足够低以至于不会对免疫细胞产生毒性含有免疫豁免组织的动物。

一种针对免疫豁免组织或细胞中产生的产物产生抗体的方法，方法是： (b) 从动物的血液或血清中分离出针对蛋白质或 RNA 的抗体。

还提供了抑制受试者免疫豁免细胞或组织生长的方法： (b) 监测受试者体内可检测基因产物的存在，直到可检测基因产物基本上仅存在于受试者的免疫豁免组织或细胞中； (c) 向受试者施用与微生物一起作用以抑制免疫豁免细胞或组织生长的治疗性化合物，或通过： (a) 向受试者施用编码可检测基因产物的修饰微生物； (b) 向受试者施用降低微生物致病性的治疗物质； (c) 监测受试者中可检测基因产物的存在，直到可检测基因产物基本上仅存在于受试者的免疫豁免组织或细胞中； (d) 终止或中断治疗化合物的给药，从而增加微生物的致病性并抑制免疫豁免细胞或组织的生长。

附图说明

菲戈。 1个：实施例中描述的不同牛痘菌株的图表。用病毒获得的结果描述在实施例中。

菲戈。 2个图1显示了在肿瘤中产生诸如核酸分子、蛋白质和代谢化合物或其他细胞产物等产物的方法的流程图。

详细说明

A. 定义

B. 用于特定肿瘤治疗的微生物

• • 1.属性
    • A.提交
      • 一、降低毒性
      • 二.在免疫豁免细胞和组织中积累，例如 B. 肿瘤，在其他器官中不是必需的
      • 三.能够激发或增强对肿瘤细胞的免疫反应。
      • 4.致病性和肿瘤抗原释放的平衡
    • B. 免疫原性
    • w。复制能力
    • D. 遗传变异
      • 一、功能变化
      • 二.外源基因表达
      • 三.可检测基因产物
      • 4.治疗基因产品
      • 五。超抗原的表达
      • 见过。表达要收获的基因产物
  • 2. 病毒
    • A. 细胞质病毒
      • 一、天花病毒
        • A. 病毒痘苗
        • B. 改良型痘苗病毒
        • CO Gen F3
        • D. 各种修改
        • 是的。李斯特的压力
      • 二.其他细胞质病毒
    • B. 腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒
  • 3.细菌
    • 好氧菌
    • B、厌氧菌
  • 4. 真核细胞

C. 减毒微生物的生产方法

• • 1. 遗传变化
  • 2. 针对以上特征进行筛选

D. 治疗方法

• • 1.行政
    • El. 施用微生物之前的步骤
    • B. 行政类型
    • 用剂量
    • D. 主管部门数量
    • Is. 联合管理
      • 一、各种微生物的管理。
      • 二.治疗化合物
    • F. 事态
  • 2. 监视
    • 微生物基因表达的监测
    • B. 肿瘤大小的随访
    • W. 抗体滴度监测
    • D. 一般健康诊断的跟进
    • Es. 与治疗相协调的随访

E. 基因产物和抗体的制备方法

• • 1. 重组蛋白和 RNA 分子的生产
  • 2.抗体的产生

F. 药物组合物、组合和试剂盒

• • 1.药物组合物
  • 2.宿主细胞
  • 3.组合
  • 4.设备

G. 例子

A. 定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语与发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本文公开内容中引用的所有专利、专利申请、已公布的申请和出版物、网站和其他已公布材料均通过引用整体并入。如果此处有多个术语定义，则以本节中的定义为准。当提及 URL 或其他标识符或地址时，可以理解这些标识符可能会发生变化，并且某些信息可能会在网络上出现和消失，但等效信息是已知的并且容易获得，例如B. 搜索互联网。和/或相应的数据库。您的参考证明了该信息的可用性和披露。

本文所用的微生物是指分离的细胞或病毒，包括真核细胞如哺乳动物细胞、病毒和细菌。根据微生物在肿瘤和其他免疫豁免细胞和组织中积累的能力，并最大限度地减少在其他组织或器官中的积累，对微生物进行修饰或选择。 Accumulation occurs through the selection or modification of microorganisms for specific properties, or through the appropriate selection of cells.可以进一步修饰微生物以改变其特性和/或递送基因产物。本文提供的微生物通常从野生型修饰而来，以表现出一种或多种特征，例如致病性降低、毒性降低、相对于正常器官或组织优先在肿瘤中积累、免疫原性增加、诱导或增强对肿瘤 B 细胞的免疫应答的能力增加增加肿瘤细胞的溶解或破坏能力，降低肿瘤细胞的溶解或破坏能力。

如本文所用，免疫豁免细胞和组织是指被免疫系统劫持的细胞和组织，例如实体瘤和受伤组织。一般来说，施用微生物会引发杀死微生物的免疫反应；然而，免疫豁免位点受到免疫反应的保护或隔离，从而使微生物能够存活并普遍复制。免疫豁免组织包括发炎组织，如受伤组织和增殖组织，如肿瘤组织。

如本文所用，与基因相关的“修饰的”是指缺失基因或编码具有一处或多处截断、突变、插入或缺失的基因产物的基因，通常伴有至少一处改变，通常是部分缺失功能。 .

如本文所用，F3基因是指病毒例如痘苗病毒中对应于痘苗病毒株LIVP的F3基因的基因或位点。这包括任何痘苗病毒或痘病毒株的 F3 基因，该基因编码的基因产物在基因组中具有基本相同或至少一个相关的生物学位点或功能。本文件中包含的 F3 基因通常至少约 40%、至少约 50%、至少约 60%、至少约 70%、至少约 80%、至少约 85%、至少约 90% ，至少约93％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％或至少约99％与SEQ ID NO：1的全长相同。由本文包括的 F3 基因编码的蛋白质通常占至少约 50%、至少约 60%、至少约 65%、至少约 70%、至少约 75%、至少约 75%、85%、至少约 90%、至少约 93%、至少约 95%、至少约 96%、至少约 97%、至少约 98%、或至少约 99%与描述于完整的 SEQ ID NO:2。还包括其他病毒中的相应基因座，当修改或删除这些基因座时，会导致毒性降低和/或在肿瘤中的积累增加（与非肿瘤细胞、组织和器官相比）。其他病毒中对应于LIVP中F3基因的位点可以通过该基因在病毒基因组中的结构定位来确定：LIVP F3基因位于痘苗病毒HindIII F片段的F14L和F15L开放阅读框之间如 Goebel 等人，Virology (1990) 179:247-266 所定义，并且与 F14L 和 F15L ORF 的方向相反；因此，相应的位点包含在其他病毒中，例如痘病毒，包括正痘病毒。

如本文所用，减弱微生物的毒性是指与未减弱的微生物相比，在施用微生物后减少或消除宿主中的有害或毒性作用。

本文所用的低毒微生物是指微生物给药后，不会在宿主的器官和组织中积累到对宿主造成伤害或器官损伤或对宿主生存的损害程度强于待治疗疾病的程度。 .

如本文所用，受试者（或生物体）是指动物，包括人。

如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类动物，包括人类、大猩猩和猴子；啮齿动物，例如小鼠和大鼠；家禽，例如鸡；山羊、牛、鹿、绵羊等反刍动物；羊和其他动物，包括猪、马、猫、狗和兔子。非人类动物不包括人类作为所考虑的动物。

如本文所用，微生物在目标组织中的积累是指在微生物足以感染宿主器官或组织的一段时间后微生物在整个生物体中的分布。正如本领域技术人员将认识到的，微生物感染的时间段将根据微生物、靶器官或组织、宿主的免疫能力和剂量而变化。通常，可以在感染微生物后约 1 天至约 1 周的时间点测定蓄积。出于本文所述的目的，微生物优先在靶组织中积累，例如凡人。 .

如本文所用，优先积累是指微生物在第一位点的积累水平高于第二位点的积累水平。因此，相对于正常组织或器官优先在免疫豁免组织如肿瘤中蓄积的微生物是指微生物在免疫豁免组织如肿瘤中的蓄积水平高于该微生物在肿瘤等免疫豁免组织中的蓄积水平。它通常。组织或器官。

如本文所用，在肿瘤或其他免疫豁免位点中产生的“化合物”是指由于存在表达一个或多个基因的引入的微生物，通常是重组微生物而在肿瘤中产生的任何化合物。例如，在肿瘤中产生的化合物可以是例如代谢物、多肽或编码的 RNA，或由重组多肽（例如酶）和肿瘤或组织的细胞机制产生的化合物。细胞。 .

如本文所用，用于递送的递送载体是指基于脂质或其他聚合物的组合物，例如脂质体、胶束或反胶束，其与药剂（例如本文提供的微生物）结合用于施用于宿主.动物

如本文所用，术语“病毒载体”在其本领域公认的含义内使用。它是指包含至少一种能够包装到病毒载体颗粒中的病毒来源元件的核酸载体构建体。病毒载体颗粒可用于在体外或体内将 DNA、RNA 或其他核酸转移到细胞中。病毒载体包括来自Semliki Forest的逆转录病毒载体、痘苗病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒（例如HSV）载体、杆状病毒载体、巨细胞病毒（CMV）载体、乳头瘤病毒载体、猿猴病毒（SV40）载体，包括但不限于载体，噬菌体载体、腺病毒载体和腺相关病毒 (AAV) 载体。

如本文所用，溶瘤病毒是指在肿瘤细胞中选择性复制的病毒。

如本文所用，“疾病或病症”是指生物体中的病理状况，例如由感染或遗传缺陷引起，并以可识别的症状为特征。

本文所用的赘生物(neoplasm)是指异常的新生长物，因此与肿瘤的含义相同，可以是良性的也可以是恶性的。与增生不同，肿瘤性增殖即使在没有原始刺激的情况下也会持续存在。

如本文所用，肿瘤性疾病是指涉及癌症的任何疾病，包括肿瘤的发生、生长、转移和进展。

如本文所用，癌症是由任何类型的恶性肿瘤引起或以任何类型的恶性肿瘤为特征的疾病的通用术语。

如本文所用，与肿瘤相关的恶性是指原发性肿瘤具有随着失去生长控制和位置控制而转移的能力。

如本文所用，转移是指远离主要受疾病过程影响的部位的异常或肿瘤细胞的生长。

如本文所用，抗癌剂或抗癌化合物（可与“抗肿瘤剂或抗肿瘤剂”互换使用）是指用于治疗癌症的任何药剂或化合物。这些包括当单独使用或与其他化合物组合使用时减轻、减少、改善、预防、诱导或维持与肿瘤疾病、肿瘤和癌症相关的缓解状态和临床症状或诊断标志物的任何药剂。 ，可以使用本文提供的组合和组合物。抗肿瘤剂的实例包括本文提供的微生物，单独或组合和/或与其他试剂组合，例如烷化剂、抗代谢物、某些天然产物、铂配位络合物、蒽二酮、取代脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、某些激素、拮抗剂和抗癌剂-多糖。

一般而言，当执行本文所述的方法并使用本文提供的微生物时，原始肿瘤并未被切除，而是用于积累所施用的微生物，并且当细胞变得可渗透或裂解以成为抗原或产物的另一种因子时。抗原可用于在宿主中引发免疫反应。可以从肿瘤中分离出抗原和产物。

如本文所用，血管生成旨在涵盖直接或间接涉及新脉管系统（新血管形成）的建立和维持的所有过程，包括但不限于肿瘤相关的新血管形成和与伤口的肿瘤相关的新血管形成。

如本文所用，“同源”是指约大于 25% 的核酸序列同一性，例如 25%、40%、60%、70%、80%、90% 或 95%。如果需要，给出百分比同源性。术语“同源性”和“同一性”经常互换使用，但蛋白质同源性可能涉及保守的氨基酸变化。通常，序列（蛋白质或核酸）以获得最高顺序匹配的方式排列（参见例如：Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing： Informatics and Genome Projects，Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, HG., eds., Humana Press, New Jersey, 1994, Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje, G.，Academic Press，1987，以及 Sequence Analysis Primer，Gribskov, M. 和 Devereux, J., eds.，M. Stockton Press，纽约，1991，Carillo 等人。 , (1988) SIAM J 应用数学 48:1073)。对于序列同一性，相同氨基酸的数量由标准比对算法程序确定，并与每个供应商设置的标准范围惩罚一起使用。基本上同源的核酸分子通常在核酸的全长或感兴趣的核酸分子全长的至少约70%、80%或90%上以中度或高度严格性杂交。还提供了含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子的核酸分子。 （可以使用保守氨基酸和相同氨基酸对蛋白质进行同源性比对，在这种情况下同一性百分比和同源性百分比会有所不同。）任何两个核酸分子是否具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%“相同”的核苷酸序列可以使用已知的计算机算法来确定，例如“FASTA”，使用例如 Pearson 等人中描述的标准参数。 . (1988) 判决书。 Nationale Akademie science USA 85:2444（其他程序包括 GCG 软件包（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)），BLASTP, BLASTN, FASTA Atschul, S.F., et al ., J Molec Biol 215:403 (1990), Guide to Huge Computers, Mr. J. Bishop, eds., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo et al (1988) SIAM J Applied Math 48:1073)。例如，可以使用国家生物技术信息中心数据库的 BLAST 函数来确定身份。其他公开或商业可用的程序包括来自 DNAStar（麦迪逊，威斯康星州）的“MegAlign”程序和来自威斯康星大学（UWG）遗传计算组（威斯康星州麦迪逊）的“Gap”程序。蛋白质和/或核酸分子的同源性或百分比同一性可以例如通过使用 GAP 计算机程序比较序列信息来确定（例如，Needleman 等人（1970）J. Mol. Biol. 48： 443, as.) 由 Smith 和 Waterman 审阅（(1981) Adv. Appl. Math. 2:482）。

简而言之，GAP 程序将相似性定义为相似的比对符号（即核苷酸或氨基酸）的数量除以两个序列中较小序列中的符号总数。 GAP 程序的标准参数可能包括：(1) 一元比较矩阵（身份为 1，非身份为 0）和 Gribskov 等人的加权比较矩阵。 (1986) 核。酸溶液。 14:6745，如 Schwartz 和 Dayhoff 编者所述，蛋白质序列和结构图谱，国家生物医学研究基金会，pp. 353-358 (1979); (2) 每个空格扣3.0，每个空格中的每个符号加罚0.10； (3) 最后的空缺没有惩罚。因此，如本文所用，术语“同一性”表示测定与参考多肽或多核苷酸之间的比较。

如本文所用，声明多肽中的氨基酸对应于公开序列中的氨基酸，例如序列表中所示的氨基酸，是指将多肽与序列表比对后鉴定的氨基酸。最大化身份。 , 或使用标准比对算法（如 GAP 算法）的同源性（保守氨基酸比对）​​。

如本文所用，术语“至少90％相同”是指与参考多肽有90％至100％的同一性。 90% 或更高水平的同一性表明这样一个事实，即出于说明目的假设比较长度为 100 个氨基酸的测试和参考多核苷酸，不超过 10%（即 100 个中的 10 个）氨基酸被包括在内。因为测试多肽不同于参考多肽。可以在测试和参考多核苷酸之间进行类似的比较。这些差异可能以随机分布的点突变形式出现在整个氨基酸序列的长度上，或者它们可能出现在一个或多个可变长度的位点，直至达到允许的最大长度，例如。 B. 10/100 氨基酸差异（约 90% 同一性）。差异定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在 85-90% 以上的同源性或同一性水平上，结果应独立于程序和定义的间隙参数；这些高级别的身份可以很容易地评估，通常不需要依赖软件。

如本文所用，“引物”是指包含两个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的寡核苷酸，通常多于三个，引物延伸产物的合成可从其开始。有利于合成的实验条件包括存在三磷酸核苷和聚合和延伸试剂，例如 DNA 聚合酶，以及适当的缓冲液、温度和 pH 值。

如本文所用，化学发光是指一种化学反应，其中能量特定地指向分子，导致其被电子激发并随后释放光子，从而发射可见光。温度对这种通道能量没有贡献。因此，化学发光涉及化学能直接转化为光能。

如本文所用，发光是指可检测的EM辐射，通常是UV、IR或可见EM辐射，其在热能化学过程的激发产物在光发射时返回到其基态时产生。化学发光是由化学反应产生的发光。生物发光是由使用生物分子（或合成版本或其类似物）作为底物和/或酶的化学反应产生的化学发光。

如本文所用，作为化学发光类型的生物发光是指生物分子，特别是蛋白质的光发射。生物发光的基本条件是在加氧酶（荧光素酶）作用于底物（荧光素）的情况下游离或结合的分子氧。生物发光是由一种酶或其他蛋白质（荧光素酶）产生的，它是一种加氧酶，它在分子氧存在下作用于荧光素底物（一种生物发光底物），将底物转化为激发态，该激发态在返回光后转变为较低的能级状态水平以光的形式释放能量。

如本文所用，用于产生生物发光的底物和酶通常分别称为荧光素和荧光素酶。当提到一个特定的物种时，每个通用术语都与它所源自的生物体的名称一起使用，例如B. 细菌荧光素或萤火虫荧光素酶。

如本文所用，萤光素酶是指催化发光反应的加氧酶。例如，细菌荧光素酶催化黄素单核苷酸（FMN）和脂肪醛的氧化，其反应产生光。在海洋节肢动物中发现的另一类荧光素酶催化 cypridin (Vargula) 的荧光素氧化，另一类荧光素酶催化鞘翅目动物的荧光素氧化。

因此，荧光素酶是指催化生物发光反应（产生生物发光的反应）的酶或发光蛋白。荧光素酶如萤火虫和高斯米我是驯鹿萤光素酶是在生物发光产生反应期间起催化作用并保持不变的酶。萤光素酶发光蛋白，例如与萤光素非共价结合的水母发光蛋白，在生物发光产生反应期间被破坏，例如，通过萤光素的释放。荧光素酶是生物体中天然存在的蛋白质或其变体或突变体，例如通过诱变产生的变体，其具有不同于天然存在的蛋白质的一种或多种特性，例如热稳定性。荧光素酶及其突变形式或修饰变体是众所周知的。出于本文件的目的，提及荧光素酶是指发光蛋白或荧光素酶。

例如，引用“我是驯鹿萤光素酶”是指从该属的成员中分离出的酶我是驯鹿或从任何其他来源获得的等效分子，例如另一种相关的桡足类，或合成制成的。应该是覆盖我是驯鹿具有不显着改变活性的保守氨基酸取代的荧光素酶。适当的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的并且通常可以在不改变所得分子的生物学活性的情况下进行。本领域技术人员将认识到，一般而言，多肽非必需区域中的单个氨基酸取代不会显着改变生物活性（参见，例如，Watson 等人，Molecular Biology of the Gene，第 4 版， 1987，Benjamin/Cummings Pub. Co.，第 224 页）。

如此处所用，“春分GFP”指该属的GFP春分及其突变体或变体。此类变体和来自其他物种的 GFP 是众所周知的，并且是本领域技术人员可获得和已知的。该命名法包括具有保守氨基酸取代的 GFP，这些氨基酸取代不会显着改变活性和物理特性，例如发射光谱和改变生物发光生成系统的光谱输出的能力。荧光素酶和荧光素及其激活剂统称为生物发光成分或试剂。通常，这些试剂的一个子集与制造项目一起提供或组合。生物发光是通过将组合物与其他试剂接触而产生的。因此，如本文所用，成分是荧光素酶、荧光素和其他因子，例如 O_2个, 毫克²⁺, 加州²⁺它们也被称为生物发光产生试剂（或试剂或组分）。

如本文所用，“生物发光底物”是指在荧光素酶和任何必需的激活剂存在下被氧化并产生光的化合物。这些底物在这里称为荧光素，它们是在生物发光反应中被氧化的底物。这样的生物发光底物包括任何荧光素或其类似物，或荧光素酶与之相互作用产生光的任何合成化合物。典型的底物包括在发光反应中在荧光素酶或蛋白质存在下被氧化的那些。因此，生物发光底物包括那些被本领域技术人员认为是荧光素的化合物。萤光素的实例包括萤火虫萤光素、cypridin（也称为vargula）、萤光素（腔肠素）、细菌萤光素，以及这些底物的合成类似物或在萤光素酶存在下在产生生物发光的反应中被氧化的其他化合物。

如本文所用，能够成为生物发光底物是指对产生生物发光底物的化学反应敏感，例如氧化或还原。例如，生物发光细菌的发光产生反应涉及通过黄素还原酶还原黄素单核苷酸（FMN）基团以还原黄素单核苷酸（FMNH2）。还原的黄素单核苷酸（底物）然后与氧气（一种激活剂）和细菌荧光素酶反应形成过氧黄素中间体，该中间体在长链醛的存在下进一步反应产生光。对于该反应，还原黄素和长链醛是底物。

如本文所用，生物发光发生器系统是指驱动生物发光反应所必需的试剂组。因此，在生物发光系统中完成生物发光反应可能需要特定的荧光素酶、荧光素和其他底物、溶剂和其他试剂。因此，生物发光产生系统是指在适当的反应条件下产生生物发光的任何试剂组。合适的反应条件是指生物发光反应发生所必需的条件，如pH、盐浓度、温度等。通常，生物发光系统包括生物发光底物、荧光素、包括酶、荧光素酶和发光蛋白的荧光素酶，以及一种或多种激活剂。特定的生物发光系统可以通过参考产生荧光素酶的特定生物体来识别；比如说他我是驯鹿生物发光系统包括我是驯鹿荧光素酶，作为从荧光素酶中分离出来的荧光素酶我是驯鹿或使用重组培养基或这些荧光素酶的修饰产生。该系统还包含完成生物发光反应所需的特定激活剂，例如氧气和荧光素酶在氧气存在下与之反应产生光的底物。

如本文所用，荧光蛋白是指具有发荧光能力（即，在一个波长吸收能量并在另一波长发射能量）的蛋白质。例如，绿色荧光蛋白指的是在大约510nm的发射光谱中具有峰的多肽。

如本文所用，基因疗法或基因疗法涉及将异源核酸例如DNA转移到哺乳动物，特别是人类的某些细胞、靶细胞中，该哺乳动物患有寻求这种治疗的疾病或病症。将诸如DNA的核酸直接引入选定的靶细胞或引入载体或其他递送载体，使得表达诸如DNA的异源核酸并由此产生编码的治疗剂。或者，异源核酸如DNA可以以某种方式介导编码治疗剂的DNA的表达，或编码产物如肽或RNA的DNA以某种方式直接或间接介导表达。一个补救措施。基因疗法也可用于递送编码基因产物的核酸，该基因产物替代缺陷基因或补充由引入它的哺乳动物或细胞产生的基因产物。引入的核酸可以编码治疗性化合物，例如其生长因子抑制剂，或肿瘤坏死因子，或其抑制剂，例如其受体，其通常不在哺乳动物宿主中产生或不在治疗中产生有效的形式。量或在治疗有用的时间。编码治疗产物的异源核酸，例如DNA，可以在引入受影响宿主的细胞之前进行修饰，以增强或以其他方式改变产物或其表达。基因治疗还可以涉及施用抑制剂或阻遏物或基因表达的其他调节剂。

如本文所用，“异源核酸”是通常不由表达它的微生物在体内产生的核酸，或由微生物产生但在不同位置或以不同方式表达或中间表达的核酸。或编码。改变内源性核酸（如 DNA）的表达并影响转录、翻译或其他受调节的生化过程。通常，异源核酸对于它被引入的细胞来说不是内源的，而是从另一个细胞获得或合成产生的。然而，异源核酸可以是内源的，但它是从不同位置表达或在其表达或序列上发生改变的核酸。通常，但不一定，该核酸编码在其表达的细胞中通常不由细胞等产生的RNA和蛋白质。异源核酸，例如DNA，也可以称为外来核酸，例如DNA。因此，异源核酸或外来核酸包括这样的核酸分子，其不存在于等同核酸分子的确切方向或位置，例如， B. DNA，存在于基因组中。它也可以指来自另一个生物体或物种的核酸分子（即，外源的）。任何核酸，例如DNA，只要本领域技术人员会识别或认为对于表达该核酸的细胞是异源的或外来的，在本文中都包括在异源核酸中；异源核酸包括也内源表达的外源添加的核酸。异源核酸的实例包括但不限于编码可追踪标记蛋白如抗药性赋予蛋白的核酸，编码治疗活性物质如抗癌药物、酶和激素的核酸，以及核酸，像 DNA 一样，编码其他类型的蛋白质，例如抗体。由异源核酸编码的抗体可以在已引入异源核酸的细胞表面上分泌或表达。

如本文所用，用于基因治疗的治疗有效产物是由异源核酸编码的产物，通常是 DNA (或 RNA 产物，例如 dsRNA、RNAi，包括 siRNA，将核酸引入宿主表达改善或消除遗传性或获得性疾病的症状、表现或治愈疾病的产品。还包括具有生物活性的核酸分子，例如 RNAi 和反义核酸分子。

如本文所用，癌症或肿瘤的治疗或药剂指任何方案和/或治疗化合物，当单独使用或与其他治疗或化合物组合使用时，减轻、减少、改善、预防或诱导缓解状态或由与血管生成受损相关的临床症状或诊断标志物维持。

本文所用的核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以是单链的或双链的。当提及任选标记的探针或引物时，例如用可检测标记，例如荧光或放射性标记，提供单链分子。此类分子通常具有这样的长度，使得它们以统计上唯一或低拷贝数（通常小于 5，通常小于 3）为目标，用于探测或启动文库。一般而言，探针或引物将包含至少 14、16 或 30 个连续核苷酸，其序列与感兴趣的基因互补或相同。探针和引物的长度可以是 10、20、30、50、100 或更多个核酸。

如本文所用，异源核酸与调节和效应核苷酸序列如启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列的可操作连接是指核酸如DNA和此类核苷酸序列之间的关系。例如，异源DNA与启动子的可操作连接是指DNA和启动子之间的物理关系，使得所述DNA的转录由识别、结合和转录的RNA聚合酶从启动子启动，特别是DNA。因此，“可操作地连接”或“可操作地连接”是指核酸如DNA与核苷酸效应子和调节序列如启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列的功能关系。例如，DNA与启动子的有效结合是指DNA与启动子之间的物理和功能关系，使得该DNA的转录由识别、结合和特异性转录DNA的RNA聚合酶从启动子开始。为了优化体外表达和/或转录，可能需要去除、添加或改变克隆的 5' 未翻译部分，以包括额外的、可能不合适的、替代的翻译起始密码子（即起始）或其他序列.它们可能会干扰转录或翻译水平的缺失或减少表达。或者，可将共有核糖体结合位点（参见，例如，Kozak J. Biol. Chem. 266:19867-19870 (1991)）立即插入起始密码子的 5' 并可增强表达。这种修改的可取性（或必要性）可以凭经验确定。

如本文所用，关于反义寡核苷酸，与RNA的至少一部分互补的序列是指具有足够互补性以能够与RNA杂交的核苷酸序列，通常在中等或高度严格的条件下，其中稳定的双链体；在双链反义核酸的情况下，可以分析单链 DNA（或 dsRNA）双链体，或者可以检查三链体形成。杂交能力取决于互补程度和反义核酸的长度。一般而言，杂交的核酸越长，它与编码 RNA 的碱基错配越多，但仍能形成稳定的双链体（或三链体，视情况而定）。本领域技术人员可以使用确定杂交复合物熔点的标准方法来确定可容忍的错配水平。

如本文所用，特定病症的症状改善，例如通过给予特定药物组合物，是指可归因于给予组合物或与给予组合物相关的任何永久性或短暂性、持续性或短暂性减轻。

如本文所用，反义多核苷酸是指与mRNA或双链DNA的有义链互补的核苷酸碱基的合成序列。在适当的条件下，有义和反义多核苷酸的混合物将导致两个分子的结合或杂交。当这些多核苷酸与 mRNA 结合（杂交）时，会抑制蛋白质合成（翻译）。当这些多核苷酸与双链 DNA 结合时，会抑制 RNA 合成（转录）。由此产生的翻译和/或转录抑制导致由有义链编码的蛋白质的合成受到抑制。反义核酸分子通常包含足够数量的核苷酸以特异性结合靶核酸，通常至少5个连续核苷酸，通常至少14或16或30个连续核苷酸，或与分子的编码部分互补的修饰核苷酸。核酸是感兴趣的编码基因。

如本文所用，“抗体”是指免疫球蛋白，无论是天然存在的还是部分或完全合成产生的，包括其保留抗体特异性结合能力的任何衍生物。因此，抗体包括具有与免疫球蛋白结合结构域同源或基本同源的结合结构域的任何蛋白质。抗体包括每个免疫球蛋白类别的成员，包括 IgG、IgM、IgA、IgD 和 IgE。

如本文所用，“抗体片段”指抗体的任何衍生物，其小于全长但保留全长抗体的至少一部分特异性结合能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab)。_2个B. 单链 Fvs (scFV)、FV、dsFV 双抗体和 Fd 片段。该片段可包含例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段通常包含至少约50个氨基酸并且通常至少200个氨基酸。

如本文所用，Fv 抗体片段由重链可变结构域（V_H) 和通过非共价相互作用连接的轻链可变结构域。

如本文所用，dsFV指具有设计的分子间二硫键的Fv，其稳定V_H-V_UE标准杆。

如此处所用，F(ab)_2个片段是免疫球蛋白在 pH 4.0-4.5 下用胃蛋白酶消化产生的抗体片段；它可以重组产生以产生等效片段。

如本文所用，Fab 片段是木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白产生的抗体片段；它可以重组产生以产生等效片段。

如本文所用，scFV 是指含有可变轻链（V_UE) 和可变重链 (v_H)由多肽接头以任何顺序共价连接。链接器足够长，可以连接两个可变域而不会产生明显干扰。接头包括 (Gly-Ser)n 残基，中间散布着一些 Glu 或 Lys 残基以增加溶解度。

如本文所用，人源化抗体是指经修饰以包含人氨基酸序列以致施用于人不会引发免疫反应的抗体。产生此类抗体的方法是已知的。例如，为了产生此类抗体，杂交瘤或其他原核或真核细胞中的编码核酸，例如大肠杆菌或者通过重组核酸技术改变表达单克隆抗体的CHO细胞以表达其中非可变区的氨基酸组成基于人抗体的抗体。已经开发了计算机程序来识别这些非可变区域。

如本文所用，双抗体是二聚体scFV；双抗体通常具有比 scFv 更短的肽接头，并且通常是二聚化的。

如本文所用，使用重组DNA技术通过重组方式产生是指使用熟知的分子生物学技术来表达由克隆的DNA编码的蛋白质。

如本文所用，术语“评估”或“确定”旨在包括就获得产品活性的绝对值以及获得指数、比率、百分比、视觉值或其他值而言的定量和定性确定。 .表明活动水平。评价可以是直接的或间接的。

如本文所用，生物活性是指化合物或微生物的体内活性或由其体内施用或由组合物或其他混合物引起的生理反应。因此，生物活性包括此类化合物、组合物和混合物的治疗效果和药学活性。可以在设计用于测试或使用此类活动的体外系统中观察生物活动。

如本文所用，治疗特定疾病的微生物或化合物的有效量是足以减轻或以其他方式减少与疾病相关的症状的量。所述量可以作为单一剂量施用或可以根据其有效的时间表施用。该量可以治愈疾病，但通常用于改善疾病症状。可能需要重复给药以实现所需的症状改善。

如本文所用，当提及两个核酸序列时“等同”是指所讨论的两个序列编码相同的氨基酸序列或等同的蛋白质。当使用等价物来指代两种蛋白质或肽或其他分子时，是指两种蛋白质或肽具有基本相同的氨基酸序列，仅氨基酸取代（例如但不限于保守变化）或结构和任何变化都不会实质性地改变蛋白质或肽的活性或功能。当等价物指的是一种特性时，该特性不需要以相同的程度存在（例如，两种肽可能具有不同水平的相同类型的酶活性），但活性通常基本相同。互补的，当提到两个核苷酸序列时，意味着两个核苷酸序列可以杂交，通常相对核苷酸之间的错配小于25%、15%或5%。如有必要，给出互补的百分比。通常，选择两个分子在高严格条件下杂交。

如本文所用，调节蛋白质活性或基因或核酸表达的试剂或化合物降低或增加蛋白质的活性或以其他方式上调或下调或改变细胞中的核酸表达或以其他方式改变它。

如本文所用，治疗或预防肿瘤疾病的方法是指任何症状，例如肿瘤、其转移、肿瘤的血管分布或表征该疾病的其他参数，减少、改善、预防、引起出现.缓解或维持缓解。这也意味着可以通过治疗消除、减少或预防肿瘤疾病和转移的特征。特性的非限制性实例包括基底膜和近端细胞外基质的不受控制的降解，内皮细胞迁移、分裂和组织成新的功能性毛细血管，以及这种功能性毛细血管的持续存在。

如本文所用，前药是在体内给药后代谢或以其他方式转化为化合物的生物学、药学或治疗活性形式的化合物。为了生产前药，对活性药物成分进行修饰，使活性成分通过代谢过程再生。可以设计前药以改变药物的代谢稳定性或运输性质、掩盖副作用或毒性、改善药物的适口性或改变药物的其他特征或性质。一旦药物活性化合物已知，体内药效学过程和药物代谢的知识允许本领域技术人员设计该化合物的前药（参见，例如，Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York , 第 388-392 页）。

如本文所用，启动子区或启动子元件或调节区是指控制与其可操作连接的DNA或RNA的转录的DNA或RNA区段。启动子区域包括足以进行 RNA 聚合酶识别、结合和转录起始的特定序列。这部分启动子区域称为启动子。此外，启动子区域包括调节该 RNA 聚合酶识别、结合和转录起始活性的序列。这些序列可能是顺式作用的或可能响应反式作用因子。根据调节类型，启动子可以是组成型的或受调节的。预期用于原核生物的示例性启动子包括噬菌体 T7 和 T3 启动子。

如本文所用，受体是指对配体具有亲和力的分子。受体可以是天然或合成分子。受体在现有技术中也可称为抗配体。如本文所用，受体和抗配体是可互换的。受体可以以其未修饰的状态使用或与其他多肽连接，包括作为同型二聚体。受体可以通过特异性结合物质或配体直接或间接地共价或非共价结合，或通过与结合成员的物理接触结合。受体的例子包括但不限于：抗体、细胞膜受体、表面受体和摄取受体、单克隆抗体、与特定抗原决定簇反应的抗血清（例如，在病毒、细胞或其他材料上）、药物、多核苷酸、酸、肽、辅助因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜和细胞器。

如本文所用，样本是指任何可能含有需要分析物测定的分析物的物质。样品可以是生物样品，例如生物流体或生物组织。生物体液的例子包括尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液、泪液、粘液、羊水等。生物组织是一组细胞，通常是某种类型，连同它们的细胞间质，构成人类、动物、植物、细菌、真菌或病毒结构的结构材料之一，包括结缔组织、上皮细胞、肌肉细胞和神经细胞。组织。生物组织的例子还包括器官、肿瘤、淋巴结、动脉和单个细胞。

如本文所用：确定错配百分比的杂交严格性如下：

• • 1) Altrigor：0,1 × SSPE, 0,1 % SDS, 65 °C。
  • 2) 中等严格性：0.2X SSPE、0.1% SDS、50°C。
  • 3) 低严格性：1.0 x SSPE，0.1% SDS，50°C。

本领域技术人员知道洗涤步骤选择稳定的杂交体并且还熟悉 SSPE 组分（参见，例如，Sambrook, EF Fritsch, T. Maniatis, in:Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，第 3 卷，p.B.13，另请参阅许多描述常用实验室解决方案的目录）。 SSPE 的 pH 值为 7.4，用 0.18 M NaCl 磷酸盐缓冲。此外，本领域技术人员将认识到杂化物的稳定性由 Tm 决定，Tm 是钠离子浓度的函数。和温度：(Tm = 81.5° C - 16 .6( log10[Na+]) + 0.41 (% G+C) – 600/l))，因此在临界洗涤条件下，对于杂交体稳定性的唯一参数是 SSPE 中的钠离子浓度（或 SSC ）和温度。本文提供的所有核酸分子还可以包括在至少低严格性、通常中等或高度严格性的条件下与所公开分子的全长的至少 70%、80%、90% 杂交的那些。应当理解，使用替代的缓冲液、盐和温度可以达到等效的限制。示例而非限制是如下使用低严格条件的方法（也参见 Shilo 和 Weinberg，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792 (1981)）：

在含有 35% 甲酰胺、5xSSC、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、5 mM EDTA、0.1% PVP、Ficoll 0.1%、含 1% 的溶液中，将含有 DNA 的过滤器在 40 °C 下预处理 6 小时。 BSA 和 500 µg/ml 变性鲑鱼精子 DNA（10X SSC 是 1.5 M 氯化钠和 0.15 M 柠檬酸钠，调节至 pH 7）。杂交在相同的溶液中进行，并进行以下修改：0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.2% BSA、100 µg/ml 鲑鱼精子 DNA、10% (w/v) 硫酸钠、葡聚糖和 5-20×10^6个每千次展示费用³²使用标有 P 的探针。滤膜在 40 °C 的杂交混合物中孵育 18-20 小时，然后在 55 °C 的含有 2x SSC、25 mM Tris-HCl（pH 值）的溶液中洗涤 1.5 小时7.4)、5 mM EDTA 和 0.1% SDS。用新鲜溶液替换洗涤溶液并在 60°C 下再孵育 1.5 小时。过滤器用吸水纸干燥并进行放射自显影。如有必要，过滤器在 65-68 °C 下进行第三次清洗，然后重新暴露在胶片上。可以使用的其他低严格条件是本领域众所周知的（例如，用于种间杂交）。

作为示例而非限制，使用中等严格条件的方法包括但不限于以下使用中等严格条件的方法：将含有 DNA 的滤膜在含有 6 x SSC 的溶液中于 55°C 孵育 6 小时， 5 x Denhart 溶液、0.5% SDS 和 100 µg/mL 变性鲑鱼精子 DNA。杂交在同一溶液和 5-20x10^6个每千次展示费用³²使用标有 P 的探针。滤膜在杂交混合物中于 55°C 孵育 18-20 小时，然后在含有 1x SSC 和 0. 1% SDS 的溶液中于 60°C 洗涤两次，每次 30 分钟。过滤器用吸水纸干燥并进行放射自显影。可以使用的其他中等严格条件是本领域众所周知的。过滤器在 37°C 下在含有 2x SSC、0.1% SDS 的溶液中洗涤 1 小时。作为示例而非限制，使用非常严格条件的方法如下：在 65°C 下，在由 6x SSC、Tris -50 mM HCl (pH 7.5) 组成的缓冲液中，对含有 DNA 的过滤器进行预杂交 8 小时过夜, 1 mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSA 和 500 µg/ml 变性鲑鱼精子 DNA。过滤器在 65 °C 的预杂交混合物中杂交 48 小时，混合物中含有 100 µg/ml 变性鲑鱼精子 DNA 和 5-20x10^6个cpm de³²P-标记的探针。过滤器在 37°C 下在含有 2x SSC、0.01% PVP、0.01% Ficoll 和 0.01% BSA 的溶液中洗涤 1 小时。随后在 50°C 下在 0.1X SSC 中洗涤 45 分钟，然后进行放射自显影。可以使用的其他非常严格的条件是本领域众所周知的。

术语基本上相同或同源或相似随着本领域技术人员所理解的上下文而变化并且通常表示至少60％或70％，优选地表示至少80％，更优选地至少90％，并且最优选地至少90％ %.-95%%。 , 96%, 97%, 98%, 99% 或更多的同一性。

如本文所用，与足够相似的产品基本相同意味着所关注的性质没有发生足够大的变化以致可以使用基本相同的产品来代替该产品。

如本文所用，基本上纯的意思是足够均匀以看起来没有容易检测的杂质，如通过本领域技术人员使用的标准分析技术如薄层色谱法(TLC)、凝胶电泳和高效液相色谱法(HPLC)所确定的. a 评估这种纯度或足够纯，进一步纯化不会明显改变物质的物理和化学性质，例如酶促和生物活性。纯化化合物以产生化学纯化合物的方法是本领域技术人员已知的。然而，基本上纯的化合物可以是立体异构体或异构体的混合物。在这种情况下，进一步纯化可能会增加化合物的比活性。

如本文所用，特异性结合多肽的分子例如抗体通常具有至少约10的结合亲和力(Ka)^6个升/摩尔，10⁷升/摩尔，10^8个升/摩尔，10⁹升/摩尔，10¹⁰/mol 或更多，并且通常以比其他蛋白质至少 2、5、10 或什至 100 倍或更多的亲和力结合感兴趣的蛋白质。例如，特异性结合蛋白酶结构域的抗体将以与全长分子相比至少约2倍、通常5倍或10倍的亲和力结合仅包含蛋白酶结构域的多肽。 , 作为酶原形式比全长酶原形式。这种特异性结合也称为选择性结合。因此，特异性或选择性结合是指与非目标位点或位点相比，对目标位点或位点具有更高的结合亲和力（通常至少 2 倍、5 倍、10 倍或更多）。

如本文所用，术语治疗剂、治疗化合物、治疗方案或化学治疗剂包括本领域技术人员已知的常规药物和药物疗法，包括疫苗。

如本文所用，“治疗”是指减轻或以其他方式有益地改变病症、病症或疾病的症状的任何方式。治疗还包括本文描述和提供的微生物的任何药物用途。

如本文所用，增殖性病症包括涉及异常细胞增殖的任何病症。此类病症包括但不限于肿瘤性疾病、牛皮癣、再狭窄、黄斑变性、糖尿病性视网膜病、炎症反应和包括伤口愈合反应在内的病症。

如本文所用，载体（或质粒）是指用于将异源核酸引入细胞以进行表达或复制的离散元件。载体通常保持附加型，但可以设计成将基因或基因的一部分整合到基因组染色体中。还考虑了作为人工染色体的载体，例如酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体。这些载体的选择和使用是本领域技术人员众所周知的。表达载体包括能够表达可操作地连接到调节序列如启动子区域的DNA的载体，能够引起所述DNA片段的表达。因此，表达载体是指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，当其被引入合适的宿主细胞时导致克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员所熟知，包括可在真核细胞和/或原核细胞中复制的表达载体和保持附加型的表达载体或整合到宿主细胞基因组中的表达载体。

如本文所用，组合是指两个或多个项目之间的任何关联。

如本文所用，组合物是指任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、乳液、液体、粉末、糊状物、水性、非水性或其任何组合。

如本文所用，流体是指能够流动的任何组合物。因此，液体包括半固体、糊剂、溶液、水性混合物、凝胶、洗剂、乳膏和其他类似组合物形式的组合物。

如本文所用，试剂盒是任选包装的组合，其包括组合的使用说明和/或用于此类使用的其他反应和组分。

为了描述清楚而不是限制，详细描述分为以下小节。

B. 用于肿瘤特异性治疗的微生物

本文提供了微生物以及产生和使用所述微生物治疗肿瘤和其他增殖性疾病和炎性疾病的方法。本文提供的微生物（或微生物）介导的治疗方法包括向宿主施用微生物，微生物在靶细胞或组织（例如肿瘤）中积累，导致细胞渗漏或裂解，引发针对宿主的免疫反应。逃逸或释放的抗原聚集，导致微生物聚集的组织或细胞受到抑制。

除了治疗癌症的基因治疗方法外，活的减毒微生物还可用于疫苗接种，例如癌症疫苗接种或抗肿瘤免疫。例如，针对肿瘤的免疫可能涉及通过微生物分泌的抗原或细胞因子引起的肿瘤特异性 T 细胞介导的反应。为此，微生物可以特异性靶向肿瘤组织，而对其他主要器官的感染最小，并且还可以进行修饰或施用以产生抗原和/或细胞因子。

本文提供的微生物和本文所述微生物的用途可以在免疫豁免细胞或组织中积累，包括肿瘤和/或转移瘤，并且还包括受损组织和细胞。虽然本文提供的微生物通常可以通过个体免疫系统的活性从施用微生物的个体中消除，但是微生物可以在免疫豁免细胞和组织（例如肿瘤）中积累、存活和增殖，因为这些是免疫豁免的区域由宿主的免疫系统分泌。因此，本文提供的应用于肿瘤和/或转移瘤的方法以及相关的治疗方法可以容易地应用于其他免疫豁免细胞和组织，包括受损细胞和组织。

1.属性

本文提供和本文方法中使用的微生物是减毒的、免疫原性的和具有复制能力的。

A.提交

本文提供的方法中使用的微生物通常是减毒的。减毒微生物在宿主中引起疾病​​的能力降低。微生物成为病原体的能力发生各种不同变化，可能导致能力下降。例如，与微生物的非减毒形式相比，微生物的毒性可能降低，在非肿瘤器官或组织中积累的能力降低，引起细胞裂解或细胞死亡的能力降低，或复制能力降低.然而，本文提供的减毒微生物至少保留了一些复制和导致免疫特权细胞和组织（例如肿瘤细胞）渗漏或裂解、经历细胞死亡或以其他方式诱导或改善对免疫细胞的免疫应答模式的能力。特权。和组织，如肿瘤细胞。

一、降低毒性

微生物可以通过产生一种或多种恶化宿主健康的化合物对其宿主产生毒性。宿主毒性可以多种方式表现，包括感染性休克、神经系统影响或肌肉影响。本文提供的微生物可降低对宿主的毒性。通过本发明的方法和组合物降低的微生物毒性的范围可以从宿主没有经历毒性作用的毒性到宿主通常不会死于微生物的毒性作用的毒性。在一些实施方案中，微生物具有降低的毒性，使得宿主通常不会因微生物在宿主中的存在而经历任何显着的长期影响，除了对肿瘤、转移性或坏死器官或组织的任何影响。例如，降低的毒性可以是持续不到一个月的轻度发烧或感染，并且在发烧或感染后宿主不会经历由发烧或感染引起的任何不利影响。在另一个例子中，降低的毒性可以测量为在给予微生物后宿主的体重意外降低约5％或更少。在其他例子中，微生物对宿主没有毒性。

LIVP 毒株（一种扩展的减毒 Lister 毒株）的痘苗病毒示例，与使用的其他痘苗病毒相比毒性降低，并经过进一步修饰。进行了改良的 LIVP。这些修饰的 LIVP 包括插入 TK 和/或 HA 基因以及指定的 F3 基因座。作为降低毒性的一个例子，与相应的野生型痘苗病毒相比，重组痘苗病毒在免疫功能低下（裸鼠）小鼠中进行了毒性测试。静脉内 (IV) 注射 1 × 10 VGL 野生型痘苗病毒（LIVP 株）⁷PFU/小鼠对裸鼠造成毒性：7只小鼠中有3只体重下降并死亡（一只小鼠在注射病毒一周内死亡，一只小鼠在注射病毒十天后死亡。其他HIV病毒也可以进行类似的修饰）。和其他病毒以降低其毒性。如有必要，可以根据经验确定此类修改。

二.在免疫豁免细胞和组织中积累，例如 B. 肿瘤，在其他器官中不是必需的

微生物可以在宿主的各种组织和器官中积累。积累可以均匀分布于整个宿主生物体或集中在一个或几个器官或组织中。本文提供的微生物可以在靶组织（例如免疫特权细胞）和组织（例如肿瘤）中积累，并且还可以转移。在一些实施方案中，相对于正常器官或组织，本文提供的微生物在免疫豁免细胞和组织（例如肿瘤细胞）中表现出的积累等于或大于在野生型微生物中发生的积累。在其他实施方案中，本文提供的微生物在免疫豁免细胞和组织（例如肿瘤细胞）中表现出的积聚等于或大于在任何其他特定器官或组织中的积聚。例如，本文提供的微生物可在免疫豁免细胞和组织（例如肿瘤细胞）中表现出至少约 2 倍、至少约 5 倍、至少约 10 倍的积累。比任何其他特定器官或组织中的积累高至少约 100 倍、至少约 1000 倍、至少约 10,000 倍、至少约 100,000 倍或至少约 1,000,000 倍。

在一些实施方案中，微生物可以在靶组织和细胞如免疫豁免细胞和组织如肿瘤细胞中积聚，而不在一种或多种选定的组织或器官中积聚。例如，微生物可以在肿瘤细胞中积聚，而不会在大脑中积聚。在另一个例子中，微生物可以在肿瘤细胞中积累而不在神经细胞中积累。在另一个例子中，微生物可以在肿瘤细胞中积聚而不会在卵巢中积聚。在另一个例子中，微生物可以在肿瘤细胞中积聚而不在血液中积聚。在另一个例子中，微生物可以在肿瘤细胞中积聚而不会在心脏中积聚。在另一个例子中，微生物可以在肿瘤细胞中积聚而不在膀胱中积聚。在另一个例子中，微生物可以在肿瘤细胞中积累而不在睾丸中积累。在另一个例子中，微生物可以在肿瘤细胞中积聚而不会在脾脏中积聚。在另一个例子中，微生物可以在肿瘤细胞中积累而不在肺中积累。

基于多种已知因素，本领域技术人员可以确定微生物在靶组织或细胞中选择性积累的所需能力，例如在免疫豁免细胞和组织中，例如肿瘤，而不是在非靶器官或组织中.本领域，包括但不限于微生物毒性、剂量、治疗的肿瘤、宿主的免疫能力和宿主的疾病状态。

本文提供了相对于正常器官或组织在免疫豁免细胞和组织（例如肿瘤）中选择性积累的例子，检查了来自肿瘤和各种​​器官的样品中各种痘苗病毒的存在。从肿瘤、睾丸、膀胱和肝脏以及大脑中回收了野生型 VGL 病毒 (LIVP)。 RVGL9 重组病毒主要存在于肿瘤中，在六只测试动物的脑组织中未发现病毒。因此，这一发现证明了用于肿瘤治疗目的的在 F3 基因中插入的重组痘苗病毒株 LIVP 的肿瘤积累特性。

三.能够激发或增强对肿瘤细胞的免疫反应。

本文中的微生物引发或增强对靶组织或细胞中的抗原的免疫应答，例如。 B.免疫豁免细胞和此类组织。 B. 肿瘤细胞。免疫反应可由多种机制触发，包括免疫刺激细胞因子的存在和可引发免疫反应的抗原化合物的释放。

为了应对感染，例如微生物感染，细胞可以发送信号以刺激针对细胞的免疫反应。此类细胞发出的信号的例子包括抗原、细胞因子和趋化因子，例如 γ 干扰素和白细胞介素 15。本文提供的微生物可引起靶细胞响应于微生物的感染而发送此类信号，导致宿主免疫系统针对靶细胞或组织例如肿瘤细胞的刺激。

或者，靶细胞或组织，例如肿瘤细胞，可以包含一种或多种化合物，当针对肿瘤产生免疫反应时，这些化合物可以被宿主的免疫系统识别。所述抗原性化合物可以组装在细胞表面或肿瘤细胞内，并且可以是蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸或其组合。微生物介导的抗原化合物释放可能导致宿主的免疫系统准备发起针对肿瘤的免疫反应。肿瘤细胞释放的抗原性化合物的量是足以在个体中引发免疫反应的任何量；例如，一种或多种肿瘤细胞释放的抗原性化合物可以在已知易受白细胞影响的体内引发宿主免疫反应。

抗原释放期的持续时间是足以使宿主对一种或多种肿瘤抗原产生免疫反应的时间段。在一些实施方案中，持续时间是足以使宿主对一种或多种肿瘤抗原产生持续免疫反应的时间段。本领域技术人员可以基于影响个体产生免疫应答所需时间的多种因素来确定这样的时间段，包括个体中肿瘤抗原的量、不同肿瘤抗原的数量、抗原的抗原性、宿主的免疫能力和抗原物质进入宿主脉管系统的途径。通常，抗原释放的持续时间可以是至少约一周、至少约10天、至少约两周或至少约一个月。

本文提供的微生物可表现出能够引起靶细胞和组织例如肿瘤细胞释放抗原性化合物的多种特性中的任一种。特性的例子是裂解细胞的能力和诱导肿瘤细胞凋亡的能力。然而，不能裂解肿瘤细胞或导致肿瘤细胞死亡的微生物可用于本文提供的方法，如果此类微生物可影响抗原化合物从肿瘤细胞的任何释放或呈递。在没有细胞裂解或细胞死亡的情况下释放或呈递抗原的多种机制是本领域已知的，并且任何这些机制都可以被本文提供的微生物利用，包括但不限于分泌抗原性化合物、增加细胞膜。当宿主的免疫系统接触到肿瘤细胞时，渗透性、细胞表面表达改变或 MHC 呈递改变。无论激活宿主免疫系统的机制如何，肿瘤中微生物存在的最终结果至少部分是刺激宿主免疫系统对抗肿瘤细胞。在一个例子中，微生物可以引发针对未被微生物感染的肿瘤细胞的免疫反应。

在一个实施方案中，本文提供的微生物可导致肿瘤细胞释放不存在于肿瘤细胞表面的抗原。肿瘤细胞可以产生可以触发免疫反应的化合物，例如蛋白质；然而，在抗原化合物不在肿瘤细胞表面的情况下，肿瘤可以增殖甚至转移，而抗原化合物不会引发免疫反应。在本方法的范围内，本文提供的微生物可导致抗原性化合物在细胞内释放，远离细胞并远离肿瘤，这可导致诱导针对此类抗原的免疫应答。即使不是肿瘤中的所有细胞都释放抗原，免疫反应最初也可能针对“泄漏”的肿瘤细胞，免疫反应的旁观者效应可能导致肿瘤细胞周围的肿瘤细胞死亡增加。

4.致病性和肿瘤抗原释放的平衡

涉及治疗靶细胞和组织（例如 B. 细胞和免疫豁免组织等）的典型程序。 B. 肿瘤设计用于快速和完全切除。例如，许多病毒、细菌或真核细胞可引起包括肿瘤细胞在内的多种细胞的裂解和/或凋亡。可以剧烈裂解或导致细胞死亡的微生物可能具有高致病性，甚至会杀死宿主。此外，依赖于这种快速和完全裂解的治疗方法通常在治疗上是无效的。

相反，本文提供的微生物在引起细胞死亡或裂解方面没有侵略性。只要它们在靶细胞或组织中积聚并导致细胞膜破裂导致抗原渗漏，从而引发免疫反应，它们就可能导致细胞死亡的能力有限或没有能力。理想的是它们的细胞凋亡或裂解作用足够缓慢或无效，以允许足够的抗原在很长一段时间内流出，从而使宿主对靶组织产生有效的免疫反应。这种免疫反应单独或与微生物的裂解/细胞凋亡作用组合导致靶组织的消除以及所述组织或细胞的进一步发展如转移和复发的消除。尽管本文提供的微生物可能具有有限的引起细胞死亡的能力，但本文提供的微生物仍然可以刺激宿主的免疫系统来攻击肿瘤细胞。因此，此类微生物不太可能对宿主表现出显着的毒性。

在一个实施方案中，微生物具有有限的（如果有的话）引起肿瘤细胞死亡的能力，同时继续引发或增强针对肿瘤细胞的免疫应答。在一个实例中，微生物介导的肿瘤细胞死亡速率低于肿瘤细胞的生长或复制速率。在另一个例子中，微生物介导的肿瘤细胞死亡速度足够慢，足以让宿主对一种或多种肿瘤抗原产生持续的免疫反应。通常，细胞死亡时间足以建立抗肿瘤免疫反应，并且可以是至少约一周、至少约10天、至少约两周或至少约一个月，这取决于宿主。和靶细胞或组织。

在另一个实施方案中，本文提供的微生物可引起肿瘤细胞的细胞死亡，而不会引起非肿瘤组织中的大量细胞死亡。在这样的实施方案中，微生物可以积极地杀死肿瘤细胞，只要在非肿瘤细胞中没有大量细胞死亡，并且任选地，只要宿主具有足够的能力来产生针对肿瘤细胞的免疫应答。

在一个实施例中，微生物引起细胞死亡的能力比宿主针对微生物的免疫反应慢。宿主控制微生物感染的能力可以通过对微生物抗原的免疫反应（例如，抗体滴度）来确定。通常，在宿主对微生物产生免疫反应后，微生物可能会在宿主体内表现出降低的致病性。因此，如果微生物导致细胞死亡的能力慢于宿主对微生物的免疫反应，则可以发生微生物介导的细胞死亡，而不会有严重疾病或宿主死亡的风险。在一个例子中，微生物导致肿瘤细胞死亡的能力比宿主对微生物的免疫反应要慢。

B. 免疫原性

本文提供的微生物也可以是免疫原性的。免疫原性微生物能够引发针对微生物的宿主免疫反应。在一个实施方案中，微生物可能具有足够的免疫原性以产生高效价的抗（微生物）抗体。本文提供的微生物可能具有诱导免疫反应的能力。免疫应答可以响应于病毒抗原而被激活，或者可以由于微生物产生感染诱导的细胞因子或趋化因子而被激活。针对微生物的免疫反应可以降低对宿主生物体致病性的可能性。

针对微生物的免疫反应也会导致靶组织或细胞（如肿瘤细胞）死亡。在一个实施方案中，针对微生物感染的免疫反应可导致针对肿瘤细胞的免疫反应，包括产生针对肿瘤抗原的抗体。在一个例子中，针对微生物的免疫反应可以通过“旁观者效应”导致肿瘤细胞死亡，在这种情况下，未感染的肿瘤细胞与受感染的肿瘤细胞一起与受感染的细胞同时死亡，或者肿瘤细胞被移除。被杀死的同时，非附近被感染的细胞外微生物杀死了微生物。由于旁观者杀死了肿瘤细胞，肿瘤细胞抗原可能会从细胞中释放出来，宿主的免疫系统可能会对肿瘤细胞抗原产生免疫反应，从而导致针对肿瘤本身的免疫反应。

在一个实施方案中，可以选择或修饰微生物以表达一种或多种抗原性化合物，包括超抗原性化合物。抗原化合物，例如超抗原，可以是内源基因的产物或外源基因的产物。超抗原，包括类毒素，是本领域已知的并且在本文别处描述。

w。复制能力

本文提供的微生物可以具有复制能力。在各种病毒或细菌系统中，所施用的微生物变得不能复制以限制对宿主的致病性风险。虽然复制无能可以保护宿主免受微生物的侵害，但它也限制了微生物感染和杀死肿瘤细胞的能力，并且通常是短暂的。相比之下，本文提供的微生物可以减毒但具有复制能力，导致低宿主毒性和主要或仅在肿瘤中积累。因此，本文提供的微生物可以具有复制能力而不会对宿主产生致病性风险。

本文提供的微生物减毒可包括但不限于降低微生物的复制能力。例如，可以修饰微生物以降低或消除复制相关活性，例如调节微生物中复制的转录激活因子。在一个例子中，一种微生物，例如病毒，可能已经修饰了病毒胸苷激酶基因。

D. 遗传变异

本文提供的微生物可以以其野生形式进行修饰。修饰可以包括多种变化并且通常包括对微生物的基因组或核酸分子的变化。核酸分子修饰的实例包括截短、插入、缺失和突变。在示例性修饰中，可以通过截短、插入、缺失或突变来修饰微生物基因。在插入的一个例子中，可以将外源基因插入到微生物的基因组中。

一、功能变化

本文提供的微生物的修饰可能导致微生物特性的改变，包括本文提供的那些，例如致病性、毒性、优先在肿瘤中积累的能力、裂解细胞或导致细胞死亡的能力、诱导针对肿瘤细胞的免疫应答的能力，免疫原性，复制能力。变体可以通过一般方法获得，例如诱变和在细胞或组织培养物中传代以及选择所需特性，如本领域已知的，如在Murphy等人，Virus Res 1994., 32:13-中以呼吸道合胞病毒为例26

也可以通过诱变方法获得变体，其中添加、删除或修饰来自野生型微生物的核酸残基。可以使用各种已知的诱变方法中的任何一种，包括基于重组的方法、基于限制性核酸内切酶的方法和基于PCR的方法。诱变方法可以针对特定的核苷酸序列，例如基因，或者它们可以是随机的，其中基于所需性状的选择方法可以用于选择突变微生物。根据选择的微生物和特定于选择的微生物的已知修饰，可以进行多种微生物修饰中的任何一种。

二.外源基因表达

本文提供的微生物还可以具有表达一种或多种外源基因的能力。基因表达可以包括由基因编码的蛋白质的表达和/或由基因编码的RNA分子的表达。在一些实施方案中，微生物可以足够高的水平表达外源基因以允许收获外源肿瘤基因产物。内源基因表达可由组成型启动子或诱导型启动子控制。表达也可能受到微生物表达的一种或多种蛋白质或RNA分子的影响。诱导型启动子系统的实例可包含嵌合转录因子，其包含融合到酵母GAL4的DNA结合结构域和单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域的孕酮受体，以及包含一系列GAL4识别序列的合成启动子亲本腺病毒的上游含有与一个或多个外源基因相连的 E1B TATA 盒；在这个示例性系统中，给受试者施用RU486可以导致外来基因的诱导。外源表达基因可包括编码治疗性基因产物的基因、编码可检测基因产物的基因，例如可用于成像的基因产物、编码用于收获的基因产物的基因、编码来自收集的抗体的抗原的基因。本文提供的微生物可用于在体内和体外表达基因。蛋白质的例子是报告蛋白（大肠杆菌β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），促进检测的蛋白质，d． h 可检测的蛋白质或能够诱导可检测信号的蛋白质（例如荧光素酶、绿色和红色荧光蛋白、转铁蛋白受体）、可用于肿瘤治疗的蛋白质（假单胞菌内毒素 A、白喉毒素、p53、Arf、Bax、肿瘤坏死因子-α，HSV TK，大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶、血管抑制素、内皮抑素、各种细胞因子）和许多其他蛋白质。

三.可检测基因产物

本文提供的微生物可表达一种或多种基因，其产物是可检测的或其产物可提供可检测信号。多种可检测的基因产物，例如可检测的蛋白质，是本领域已知的并且可以与本文提供的微生物一起使用。可检测蛋白质包括受体或可特异性结合可检测化合物的其他蛋白质、可发出可检测信号如荧光信号的蛋白质、可催化可检测反应或催化可检测产物形成的酶。

在一些实施方案中，微生物表达编码能够发出可检测信号或催化可检测反应的蛋白质的基因。编码能够发出可检测信号或催化可检测反应的蛋白质（例如发光或荧光蛋白）的各种 DNA 序列是已知的，并且可以用于本文提供的微生物和方法中。编码发光蛋白的基因的例子包括细菌荧光素酶基因。哈氏弧菌(Belas et al., Science 218 (1982), 791-793)，细菌萤光素酶费氏弧菌(Foran and Brown, Nucleic Acids Res. 16 (1988), 177)，Vagalume-Luciferase (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7 (1987), 725-737)，Aequorin aus平等的胜利(Prasher et al., Biochem. 26 (1987), 1326–1332)，海肾萤光素酶冯海肾(Lorenz et al., PNAS USA 88 (1991), 4438-4442)和绿色荧光蛋白平等的胜利(Prasher et al. (1987) Gene 111:229-233)。这些基因在微生物中的转化和表达可以允许检测微生物菌落，例如，使用低光照相机。 lux A 和 lux B 基因的融合可产生功能齐全的荧光素酶蛋白（Escher 等人 (1989) PNAS 86:6528-6532）。这种融合基因（Fab2）被引入多种微生物，然后进行微生物感染和基于荧光素酶表达的成像。在一些实施方案中，细菌表达的荧光素酶可能需要外源添加的底物，例如癸醛或腔肠素，用于发光。在其他实施例中，微生物可以表达全长勒克斯操纵子，其可以包括可以提供荧光素酶底物的蛋白质，例如癸醛。例如，包含 lux 操纵子完整序列的细菌在腹膜内、肌肉内或静脉内注射时，可以在活小鼠中观察和定位细菌，表明荧光素酶光发射可以穿透组织并在外部检测到（Contag 等人，Mol微生物学 18 (1995), 593-603)。

在其他实施例中，微生物可表达可结合可检测化合物或可产生可结合可检测化合物的产物的基因。多种基因产物，例如可以特异性结合可检测化合物的蛋白质，是本领域已知的，包括受体、金属结合蛋白、配体结合蛋白和抗体。可以使用多种可检测的化合物并通过多种已知的成像方法使其可视化。化合物的实例包括受体配体和抗体的抗原。可以根据要使用的成像方法编写活页夹。成像模态的示例包括多种磁共振成像模态中的任何一种，例如磁共振成像 (MRI) 和磁共振波谱学 (MRS)，并且还包括多种断层摄影模态中的任何一种，包括计算机断层扫描 (CT)、计算机断层扫描计算机断层扫描 (CAT)、电子束计算机断层扫描 (EBCT)、高分辨率计算机断层扫描 (HRCT)、内摆线断层扫描、正电子发射断层扫描 (PET)、单光子发射计算机断层扫描 (SPECT)、螺旋计算机断层扫描和超声断层扫描。

用于磁共振成像的合适标记物是本领域已知的并且包括例如钆螯合物和氧化铁。在造影剂中使用螯合物是本领域已知的。用于层析成像方法的合适标记物是本领域技术人员已知的并且包括例如β发射体，例如¹¹C，¹³北方,¹⁵那个或⁶⁴Cu 或 (b) γ 发射体如¹²³I. 其他可用作例如 PET 示踪剂的示例性放射性核素包括⁵⁵公司，⁶⁷需要，⁶⁸需要，⁶⁰铜(II),⁶⁷铜(II),⁵⁷嗯，⁵²相信你¹⁸F. 有用的放射性核素标记试剂的例子是⁶⁴Cu 标记的工程化抗体片段（Wu 等人，PNAS USA 97 (2002), 8495-8500），⁶⁴Cu-markiertes 生长抑素（Lewis 等人，J. Med. Chem. 42 (1999), 1341-1347），⁶⁴Cu-pyruvaldeído-bis(N4-methylthiosemicarbazon)-(64Cu-PTSM)（Adonai 等人，PNAS USA 99（2002），3030-3035），⁵²Fecitrato（Leenders 等人，J. Neural. Transm. Supl. 43 (1994), 123-132），⁵²铁/⁵²mMn-柠檬酸 (Calonder et al., J. Neurochem. 73 (1999), 2047-2055) e⁵²用 Fe 标记的氢氧化铁-蔗糖复合物（Beshara 等人，Br. J. Haematol. 10^4个(1999), 288–295, 296–302)。

4.基因治疗产品

本文提供的微生物可表达一种或多种基因，其产物导致细胞死亡或其产物引发抗肿瘤免疫反应，此类基因可被视为治疗基因。多种治疗性基因产物，例如毒性或凋亡蛋白或siRNA，是本领域已知的并且可以与本文提供的微生物一起使用。治疗基因可以通过直接杀死宿主细胞起作用，例如作为通道蛋白或其他裂解蛋白，诱导细胞凋亡，抑制必需的细胞过程，诱导针对细胞的免疫反应，或通过与化合物相互作用。它具有类似的效果，例如将效力较低的化合物转化为细胞毒性化合物。

在一些实施例中，微生物可表达治疗性蛋白质。本领域已知大量可以表达以治疗肿瘤的治疗性蛋白质，包括但不限于肿瘤抑制因子、毒素、细胞生长抑制蛋白和细胞因子。此类蛋白质的示例性和非限制性列表包括 WT1、p53、p16、Rb、BRCA1、囊性纤维化跨膜调节因子（CFTR）、因子 VIII、低密度脂蛋白受体、β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖脑苷脂酶。胰岛素、甲状旁腺激素、α-1-抗胰蛋白酶、rsCD40L、Fas-配体、TRAIL、TNF、抗体、microkin E492、白喉毒素、假单胞菌属外毒素，大肠杆菌毒素 Shig, Escherichia coliVerotoxin 1 e Hiperforina。

在其他实施方案中，微生物可以表达将活性较低的化合物转化为导致肿瘤细胞死亡的化合物的蛋白质。用于转化此类前药化合物的示例性方法包括酶促转化和光解转化。多种蛋白质/化合物对是本领域已知的，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦、水痘带状疱疹胸苷激酶/更昔洛韦、胞嘧啶脱氨酶/5-氟尿嘧啶、嘌呤核苷磷酸化酶甲基嘌呤/6 -脱氧核苷、β-内酰胺酶/头孢菌素多柔比星、羧肽酶 G2/4-[(2-氯乙基)(2-甲磺氧乙基)氨基]苯甲酰-L-谷氨酸、细胞色素 P450/对乙酰氨基酚、辣根过氧化物酶/吲哚酸 -3-乙酸、1 -chloromethyl-5-hydroxy-1,2-dihydro-3H-benz[e]indole、β-葡萄糖醛酸酶/表柔比星葡萄糖醛酸苷、胸苷磷酸化酶/5'-脱氧-5-氟尿苷、脱氧胞苷激酶/阿糖胞苷和利纳酶/亚麻苦苷。

在另一个实施方案中，治疗基因产物可以是siRNA分子。 siRNA分子可以针对肿瘤促进基因的表达，例如但不限于致癌基因、生长因子、血管生成促进基因或受体。 siRNA 分子还可以靶向任何对细胞生长、细胞复制或细胞存活必不可少的基因的表达。 siRNA 分子还可以靶向稳定细胞膜或限制肿瘤细胞释放的肿瘤细胞抗原数量的任何基因的表达。根据选择的siRNA靶点，可以很容易地确定siRNA的设计； siRNA 设计和基因下调的方法是本领域已知的，如美国专利公开号 20030198627 中所例示的。

在一个实施方案中，治疗化合物可以由调节序列控制。可在例如哺乳动物宿主细胞中操作的适当调节序列是本领域众所周知的。在一个例子中，调节序列可以包含天然或合成的痘苗病毒启动子。在另一个实施方案中，调节序列包含痘病毒启动子。当使用病毒微生物时，可以使用强晚期启动子来实现外源基因的高水平表达。然而，也可以使用早期和中期启动子。在一个实施方案中，启动子包括早期和晚期启动子元件，例如，痘苗病毒 p7.5 早期/晚期启动子、痘苗病毒 p11 晚期启动子、合成的痘苗 pE/L 早期/晚期启动子（Patel 等人， (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85, 9431-9435 Davison 和 Moss (1989) J Mol Biol 210, 749-769 Davison 等人 (1990) Nucleic Acids Res. 18, 4285-4286 Chakrabarti 等人, (1997)生物技术 23，1094-1097）。

五、超抗原的表达

本文提供的微生物可以被修饰以表达一种或多种超抗原。超级抗原是能够引发有效免疫反应的抗原，通常由大 T 细胞反应触发。本领域已知多种超级抗原，包括但不限于白喉毒素、葡萄球菌肠毒素（SEA、SEB、SEC1、SEC2、SED 、SEE 和 SEH）、中毒性休克综合症毒素 1、去角质毒素 (EXft)、链球菌毒素、热原外毒素 A、B 和 C（SPE A、B 和 C）、乳腺肿瘤病毒蛋白小鼠 (MMTV) B. 链球菌 M 蛋白, 产气荚膜梭菌肠毒素 (CPET), 支原体关节炎超抗原。

由于许多超抗原也是毒素，当需要表达具有降低毒性的微生物时，可以修饰超抗原以保留至少一些超抗原同时降低其毒性，从而产生类毒素样化合物。多种重组超抗原和超抗原类毒素是本领域已知的，它们可以容易地在本文提供的微生物中表达。类毒素的实例包括如美国专利No.5,565,528中所述的白喉类毒素类毒素。 6,455,673 和葡萄球菌肠毒素类毒素，如美国专利公开号 20030009015 中所述。

见过。表达要收获的基因产物

Exemplary genes expressible by a microorganism for the purpose of harvesting include human genes. An exemplary list of genes includes the list of human genes and genetic disorders authored and edited by Dr. Victor A. McKusick and his colleagues at Johns Hopkins University and elsewhere, and developed for the World Wide Web by NCBI, the National Center for Biotechnology Information. Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM™. Center for Medical Genetics, Johns Hopkins University (Baltimore, Md.) and National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine (Bethesda, Md.), 1999. and those available in public databases, such as PubMed and GenBank (see, e.g., (ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM) These genes include, but are not limited to: 239f2h9, 3pk, 4ebp1, 4ebp2, al1, al2 ml, al2 m2, al2 m3, al2 m4, al5, alb, albg, alst, a2m, a2mr, a2mrap, aa, aaa, aaa, aabt, aac1, aac2, aact, aadac, aanat, aars, aas, aat, aavs1, abc1, abc2, abc3, abc7, abc8, abcr, abi1, abl1, abl2, abl1, abo, abp, abp1, abpa, abpx, abr, acaa, acac, acaca, acacb, acad1, acadm, acads, acadsb, acadv1, acat, acat1, acat2, acc, accb, accn1, accn2, accpn, ace1, ach, ache, achm1, achm2, achrb, achrd, achrg, acls, acly, aco1, aco2, acox, acox1, acox2, acox3, acp1, acp2, acp5, acpp, acr, acrvl, acs3, acs3, acs4, act2, act35, actal, acta2, acta3, actb, actc, actg1, actg2, act11, actn1, actn2, actn3, actsa, acug, acvr1, acvr2b, acvrl1, acvrlk1, acvrlk2, acvrlk3, acyl, ad1, ad2, ad3, ad4, ad5, ada, adam10, adam11, adam12, adam3, adam3a, adam3b, adam8, adar, adarb1, adarb2, adcp1, adcp2, adcy1, adcy2, adcy3, adcy3, adcy4, adcy5, adcy6, adcy7, adcy8, adcy9, adcyapl, adcyaplr1, add1, add2, add3, add1, adfn, adh1, adh2, adh3, adh4, adh5, adh7, adhaps, adhc1, adhr, adhr, adk, ad1, adm, admlx, adoral, adora2a, adora2b, adora21, adora21, adora3, adprt, adral a, adralb, adral c, adrald, adra2a, adra2b, adra2c, adra211, adra212, adra2r, adrb1, adrb1r, adrb2, adrb2r11, adrb3, adrbk1, adrbk2, ads1, adss, adtb1, adx, adxr, ae1, ae2, ae3, aeg11, aemk, aes, af10, af17, af4, af6, af8t, af9, afd1, afdn, afg3, afg311, afm, afp, afx1, aga, agc1, ager, ag1, agmx1, agm×2, agp1, agp7, agps, agrn, agrp, agrt, ags, agt, agti1, agtr1, agtr1a, agtr2, agtr11, agxt, ahc, ahcy, ahd, ahds, ahnak, aho2, ahr, ahsg, ahx, aib1, aic, aic1, aied, aih1, aih2, aih3, aiml, air, airc, aire, ak1, ak2, ak3, akap149, akt1, akt2, aku, alad, alas1, alas2, alb, alb2, alba, alcam, ald, aldh1, aldh10, aldh2, aldh3, aldh4, aldh5, aldh6, aldh9, ald11, aldoa, aldob, aldoc, aldr1, alds, alk, alk1, alk2, alk3, alk6, alms1, alox12, alox15, alox5, alp, alpi, alp1, alpp, alpp12, alr, alr, als1, als2, als4, als5, alss, ambn, ambp, amcd1, amcd2b, amcn, amcn1, amcx1, amdl, amdm, amelx, amely, amfr, amg, amgl, amgx, amh, amhr, amhr2, aml1, aml1t1, aml2, aml3, amog, ampd1, ampd2, ampd3, amph, amph1, ampk, amt, amy1a, amy1b, amy1c, amy2a, amy2b, an 2, anc, ancr, ang, ang1, anh1, ank1, ank2, ank3, anop1, anova, anp, anpep, anpra, anprb, anprc, ans, ant1, ant2, ant3, ant3y, anx1, anx11, anx13, anx2, anx214, anx3, anx4, anx5, anx6, anx7, anx8, aoah, aoc2, aox1, ap2tf, apah1, apba1, apba2, apbb1, apbb2, apc, apcs, ape, apeced, apeh, apex, api1, api2, api3, apj, ap1p, ap1p1, ap1p2, apnh, apo31, apoa1, apoa2, apoa4, apob, apobec1, apoc1, apoc2, apoc3, apoc4, apod, apoe, apoer2, apoh, apolmt, apolp1, apolp2, app, appbp1, app11, aprf, aprt, aps, apt1, apt11g1, apxl, apy, aqdq, aqp0, aqp1, aqp2, aqp21, aqp3, aqp4, aqp5, aqp6, aqp7, ar, ar1, ara, araf1, araf2, arcn1, ard1, ard1, areg, arf1, arf2, arB3, arf41, arf5, arg, arg1, args, arh12, arh6, arh9, arha, arhb, arhc, arhg, arhgap2, arhgap3, arhgap6, arhgdia, arhgdib, arhh, arix, ar12, ammd1, amt, amt1, aro, arp, arp1, arpkd, arr3, arrb1, arrb2, arsa, arsacs, arsb, arsc1, arsc2, arsd, arse, arsf, art, art1, art3, art4, arts, arvd1, arvd2, arvd3, arvd4, as, asat, asb, ascl1, asc12, asct1, asd1, asd2, asgr1, asgr2, ashl, asip, asl, asln, asml, asma, asmd, asmt, asmt1x, asmty, asnrs, asns, aspa, as, astm1, astn, asv, at, at1, at2r1, at3, ata, atbfl, atcay, atf1, ath1, aths, atm, atoh1, atox1, atp1a1, atp1a2, atp1a3, atp1all, atp1b1, atpIb2, atp1b3, atp1b11, atp1g1, atp2a1, atp2a2, atp2a3, atp2b, atp2b1, atp2b2, atp2b2, atp2b3, atp2b4, atp4a, atp4b, atp5, atp5a, atp5b, atp5g1, atp5g2, atp5g3, atp5o, atp6a, atp6b1, atp6c, atp6e, atp6n1, atp7a, atp7b, atpm, atpsb, atpsk1, atpsk2, atq1, atr, atr, atr1, atr1, atr2, atrc1, atrc2, atrx, ats, atsv, atx1, atx2, au, auf1, auf1a, aut, avcd, aved, avp, avpr1a, avpr1b, avpr2, avpr3, avrp, avsd, awa1, ax1, ax1g, axsf, azf1, azf2, azgp1, azu1, b120, b144, blg1, b29, b2m, b2mr, b3galt4, b4galt1, ba2r, bab1, bag1, bai1, bai2, bai3, bak1, bam22, bap1, bap135, bapx1, bard1, bark2, bas, bat1, bat2, bat3, bat4, bat5, bax, bb1, bbbg1, bbbg2, bbs1, bbs2, bbs3, bbs4, bbs5, bcas1, bcat1, bcat2, bcate2, bcd1, bcei, bche, bckdha, bckdhb, bcl1, bcl10, bcl2, bcl2a1, bcl212, bcl3, bcl5, bcl6, bcl7, bcl7a, bcl8, bcl9, bclw, bcm, bem1, bcma, bcns, bens, bcp, bcpm, bepr, bcr, bcr12, bcr13, bcr14, besg1, bet1, bet2, bdb, bdb1, bdc, bde, bdkrb1, bdkrb2, bdmf, bdmr, bdnf, bed, bedp, bek, bene, bevi, bf, bf1, bf2, bfhd, bfic, bfls, bfnic2, bfp, bfsp1, bft, bglap, bgmr, bgn, bgp, bhd, bhpcdh, bhr1, bicd1, bid, bigh3, binl, bir, bjs, bkma1, blast1, blau, blk, blm, blmh, bltr, blvra, blvrb, blym, bmal1, bmd, bmh, bmi1, bmrp1, bmp2, bmp2a, bmp2b1, bmp3, bmp4, bmp5, bmp6, bmp7, bmp8, bmpr1a, bmpr1b, bmx, bmyb, bn51t, bnc, bnc1, bnp, bor, bpad, bpag1, bpag2, bpes, bpes1, bpes2, bpgm, bph1, bpi, br, br140, braf, brcal, brca2, brca3, brcacox, brcd1, brcd2, brdt, brfl, brhc, bric, brks, bm3a, bm3b, bm3c, brm1, brw1c, bs, bsap, bsep, bsf2, bsg, bsnd, bssl, bst1, bst2, btak, btc, btd, bteb, bteb1, btg1, btg2, bths, btk, btk1, btn, bts, bub1b, bubr1, bwr1a, bwr1b, bws, bwscrla, bwscrlb, bzrp, bzx, c11orf13, c1nh, c1qa, c1qb, c1qbp, c1qg, c1r, c1s, c2, c21orfl, c21orf2, c21orf3, c2ta, c3, c3br, c3dr, c3g, c4a, c4b, c4 bpa, c4 bpb, c4f, c4s, c5, c5ar, c5r1, c6, c7, c8a, c8b, c8g, c9, ca1, ca12, ca125, ca2, ca21 h, ca3, ca4, ca5, ca6, ca7, ca8, ca9, caaf1, cabp9k, cac, cac, caca, cacd, cacna1a, cacna1b, cacna1c, cacna1d, cacna1e, cacna1f, cacna1s, cacna2, cacnb1, cacnb2, cacnb3, cacnb4, cacng, cacnl1al, cacnl1a2, cacnl1a3, cacnl1a4, cacnl1a5, cacnl1a6, cacnl2a, cacnlb1, cacn1g, cacp, cact, cacy, cad, cad11, cadasi1, cae1, cae3, caf, cafla, caga, cagb, cain, cak, cak1, cal11, calb1, calb2, calb3, calcl, calc2, calca, calcb, calcr, cald1, calla, calm1, calm2, calm3, calm11, calm13, calna, calna3, calnb, calnb1, calr, cals, calt, calu, cam, camk4, camkg, camll, camlg, camp, can, canp3, canx, cap2, cap3, cap37, capb, capg, cap1, capn1, capn2, capn3, capn4, cappa2, cappb, capr, caps, capza2, capzb, car, carp, cars, cart1, cas, cas2, casi1, casp1, casp10, casp2, casp3, casp3, casp4, casp5, casp6, casp7, casp8, casq1, casq2, casr cast, cat, cat1, cat4, catf1, catm, cav1, cav2, cav3, cbbm, cbd, cbfal, cbfa2, cbfa2t1, cbfa3, cbfb, cbg, cb1, cb12, cbln2, cbp, cbp, cbp2, cbp68, cbr1, cbs, cbt, cbtl, cc10, cca, cca1, cca11, cca12, ccb11, ccckr5, ccg1, ceg2, cchl1a1, cchl1a2, cchl1a3, cchlb1, cek, cckar, ckbr, cc1, cem1, ccm2, ccm3, ccn1, ccna, ccnb1, cenc, cend1, ccnd2, cnd3, cene, ccnf, cengl, ccnh, ccnt, ccnt1, cco, ccr10, ccr2, ccr3, ccr9, csp, cct, ccv, cczs, cd, cd10, cd11a, cd11b, cd11c, cd13, cd137, cd14, cd15, cd151, cd156, cd16, cd164, cd18, cd19, cd1a, cd1b, cd1c, cd1d, cd1e, cd2, cd20, cd22, cd23, cd24, cd26, cd27, cd271, cd28, cd281g, cd281g2, cd30, cd32, cd33, cd34, cd36, cd3611, cd3612, cd37, cd38, cd39, cd3911, cd3d, cd3e, cd3g, cd3z, cd4, cd40, cd401g, cd41b, cd43, cd44, cd45, cd46, cd47, cd48, cd49b, cd49d, cd5, cd53, cd57, cd58, cd59, cd51, cd6, cd63, cd64, cd68, cd69, cd7, cd70, cd71, cd72, cd74, cd79a, cd79b, cd80, cd81, cd82, cd82, cd86, cd8a, cd8b, cd8b1, cd9, cd94, cd95, cd97, cd99, cda, cda1, cda3, cdan1, cdan2, cdan3, cdb2, cdc2, cdc20, cdc25a, cdc25b, cdc25c, cdc27, cdc211, cdc212, cdc214, cdc34, cdc42, cdc51, cdc7, cdc711, cdcd1, cdcd2, cdcd3, cdc11, cdcre1, cdg1, cdgd1, cdgg1, cdgs2, cdh1, cdh11, cdh12, cdh13, cdh14, cdh 15, cdh16, cdh16, cdh17, cd2, cdh3, cdh3, cdh5, cdh7, cdh8, cdhb, cdhh, cdhp, cdhs, cdk2, cdk3, cdk4, cdk5, cdk7, cdk8, cdk9, cdkn1, cdkn1a, cdkn1b, cdkn1c, cdkn2a, cdkn2b, cdkn2d, cdkn3, cdkn4, cd11, cdm, cdmp1, cdmt, cdpx1, cdpx2, cdpxr, cdr1, cdr2, cdr3, cdr62a, 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cord6, cort, cot, cox10, cox4, cox5b, cox6a1, cox6b, cox7a1, cox7a2, cox7a3, cox7am, cox8, cp, cp107, cp115, cp20, cp47, cp49, cpal, cpa3, cpb2, cpb2, cpd, cpe, cpetr2, cpm, cpn, cpn1, cpn2, cpo, cpp, cpp32, cpp32, cppi, cpsl, cpsb, cpsd, cptla, cptlb, cpt2, cpu, cpx, cpx, cpxd, cr1, cr2, cr3a, crabp1, crabp2, crapb, crarf, crat, crbp 1, crbp2, crd, crdl, creb1, creb2, crebbp, creb 1, crem, crfb4, crfr2, crh, crhbp, crhr, crhr1, crhr2, crip, crk, crkl, crnl, crmp1, crmp2, crp, crpl, crs, crslc, crs2, crs3, crsa, crt, crtl1, crtm, crx, cry1, cry2, cryal, crya2, cryaa, cryab, crybl, cryb2, cryb3, crybal, cryba2, cryba4, crybb1, crybb2, crybb3, crygl, cryg2, cryg3, cryg4, cryg8, cryg, cryga, crygb, crygc, crygd, crygs, crym, cryz, cs, csa, csb, csbpl, csci, csd, csd2, csda, cse, cse11, csf1, csf1r, csf2, csf2ra, csf2rb, csf2ry, csf3, csf3r, csh1, csh2, csk, csmf, csn1, csn10, csn2, csn3, csnb1, csnb2, csnb3, csnkla1, csnk1d, csnk1e, csnk1g2, csnk2a1, csnk2a2, csnk2b, csnu3, cso, cspb, 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hsn1, hsorc1, hsp27, hsp73, hspa1a, hspa1b, hspa11, hspa2, hspa3, hspa4, hspa5, hspa6, hspa7, hspa8, hspa9, hspb1, hspb2, hspc2, hspca11, hspca12, hspca13, hspca14, hspcb, hspg1, hspg2, hsr1, hsst, hstd, hstf1, htc2, htf4, htk, htk1, ht1, htlf, htlvr, htn1, htn2, htn3, htnb, htor, htrla, htrlb, htrld, htrle, htrlel, htrlf, htr2a, htr2b, htr2c, htr3, htr4, htr5a, htr6, htr7, htrxl, htsl, htt, htx, htxl, hub, hud, hup2, hur, hus, hyls, hvbsl, hvbs6, hvbs7, hvem, hvh2, hvh3, hvh8, hxb, hxbl, hy, hya, hya11, hyd2, hygn1, hyl, hyp, hyplip1, hypp, hypx, hyr, hyrcl, hys, ia1, ia2, iap, iapp, iar, iars, ibd1, ibd2, ibm2, ibsp, ica1, icam1, icam2, icam3, icca, ich1, icr2, icr2b, ics1, id1, id2, id3, id4, ida, idd, iddml, iddm10, iddm 1, iddm12, iddm13, iddm15, iddm17, iddm2, iddm3, iddm4, iddm5, iddm6, iddm7, iddm8, iddmx, ide, idg2, idh1, idh2, idh3a, idh3g, ido, ids, idua, ierl, ier3, iex1, if, ifcr, ifgr2, ifil6, ifi27, ifi35, ifi4, ifi5111, ifi54, ifi56, ifi616, ifi78, ifna1, ifna10, 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inhbb, inhbc, ini1, ink4b, inlu, inp10, inpp1, inpp5a, inpp5b, inpp5d, inpp11, ins, insig1, ins1, ins13, ins14, insr, insrr, int1, int111, int2, int3, int4, int6, iosca, ip2, ipfl, ip1, ipm150, ipox, ipp, ipp2, ipw, iqgap1, ir10, ir20, ireb1, ireb2, irf1, irf2, irf4, irf4, irr, irs1, isa, iscw, is11, islr, isot, issx, it15, itba1, itba2, itf, itf2, itgal, itga2, itga2b, itga4, itga5, itga6, itga7, itgad, itgal, itgam, itgav, itgax, itgb1, itgb2, itgb3, itgb4, itgb6, itgb7, iti, itih1, itih2, itih3, itih4, itih11, itil, itk, itml, itpa, itpka, itpkb, itprl, itpr2, itpr3, itsn, ivd, ivl, jagl, jakl, jak2, jak3, jbs, jcap, jh8, jip, jk, jme, jmj, joag, jpd, jrk, jrkl, jtkl4, jtyl, jun, junb, jund, jup, jv18, jws, k12t, kai1, kal1, kar, kars, katp1, kcna1, kcna10, kcna1b, kcna2b, kcna3, kcna4, kcna5, kcna6, kcna7, kcna8, kcna9, kcnab1, kcnab2, kcnb1, kcnc1, kcnc2, kcnc3, kcnc4, kcne1, kcnh1, kcnh2, kcnj1, kcnj10, kcnj1, kcnj12, kcnj15, kcnj3, kcnj4, kcnj5, kcnj6, kcnj6, kcnj7, kcnj8, kcnjn1, kcnk1, kcnk2, kcnk3, kcmna1, kcnq1, kcnq2, kcnq3, kcnq4, kcns2, kd, kdr, kel, kera, kfl, kfs, kfsd, kfsl, khk, kiaa0122, kid, kidl, kif2, kif3c, kif5b, kipl, kip2, kissl, kit, klc2, klk1, klk2, klk3, klk3, klkb1, klkr, klrb1, klrc1, klrc2, klrc3, klrc4, klrd1, klst, kms, kms, kng, kno, kns1, kns2, kns 1, kns14, kox1, kox11, kox12, kox13, kox15, kox16, kox18, kox19, kox2, kox2, kox22, kox25, kox30, kox32, kox4, kox5, kox6, kox7, kox9, kpna3, kpps1, kpps2, krag, kraslp, kras2, krevl, krg2, krn1, krn11, krox20, krt1, krt10, krt12, krt13, krt14, krt15, krt16, krt17, krt18, krt19, krt2a, krt2e, krt3, krt4, krt5, krt6a, krt6b, krt7, krt8, krt9, krtha2, krtha5, krthb1, krthb6, ks, ktn1, ku70, kup, kylqt1, kwe, 11.2, 11 cam, 123mrp, lab7, lab72, lac, lacI, lacs, lad, lad, lad1, laf4, lag3, lag5, lair1, lak1, lalba, lal1, lam1, lama1, lama2, lama3, lama3, lama4, lama5, lambl, lamb2, lamb2, lamb2t, lamb3, lambr, lamc1, lamc2, lamm, lamnb2, lamp, lamp1, lamp2, lamr1, lams, lap, lap18, laptm5, lar, lar1, lard, large, lars, lbp, lbr, lca, lcal, lcad, lcamb, lcat, lccs, lcfs2, lch, lck, lcn1, lcn2, lco, lcp1, lcp2, lct, ld, ld78, ldb1, ldb2, ldc, ldh1, ldh3, ldha, ldhb, ldhc, ldlr, le, lect2, lefl, lefty1, lefty2, lep, lepr, lerk5, lerk8, leu1, leu7, leut, lfa1a, lfa3, lfh11, lfp, igals1, lgals3, lgals3 bp, lgals7, lgcr, igmd1, lgmd1a, lgmd1b, lgmd1c, lgmd1d, lgmd2b, lgmd2c, lgmd2d, 1 gmd2e, lgmd2f, lgmd2g, lgmd2h, Igs, lgtn, lhb, lhcgr, lhs, lhx1, lhx3, li, li2, lif, lifr, ligl, lig3, lig4, lim1, lim2, limab1, limk1, limp11, lip2, lipa, lipb, lipc, lipd, lipe, lipo, lis1, lis2, lisx, litaf, lkb1, lkn1, llg11, lman1, lmn1, lmn2, lmna, lmnb1, lmnb2, lmo1, lmo2, lmo3, lmo4, lmo5, lmp10, lmp2, lmp7, lmpx, lms, lmx1, lmx1a, lmx1b, lmyc, lnhr, lnrh, locr, loh11cr2a, lor, lot1, lox, lox1, lox11, lpa, lpaab, lpaata, lpap lpc1, lpc2d, lpd1, lph, lpi, lp1, lpna3, lpp, lps, lpsa, lqt1, lqt2, lqt3, lqt4, lr3, Irel, lre2, lrp, lrp1, lrp2, lrp5, lrp7, lrp8, lrpap1, lrpr1, irs1, lsamp, lsirf, ls1, lsn, lsp1, lss, lst1, lta, lta4h, ltb, ltb4r, ltbp1, ltbp2, ltbp2, ltbp3, ltbp3, ltbr, ltc4s, itf, ltk, ltn, lu, lum, luxs, luzp, lw, ly64, ly6e, ly9, lyaml, lyb2, lyfl, lyll, lyn, lyp, lyst, lyt10, lyz, lztr1, m11s1, m130, m17s1, m17s2, m195, m1s1, m3s1, m4s1, m6a, m6b, m6p2, m6pr, m6s1, m7v1, m7vs1, mab211, mac1a, mac2, mac25, macam1, macs, mad, mad211, madd, madh1, madh2, madh3, madh4, madh5, madh6, madh6, madh7, madh9, madm, madr1, maf, mafd1, mafd2, mag, mage1, mageb3, mageb4, mage11, magoh, magp, magp1, magp2, mak, ma1, ma11, man2a2, manal, mana2, mana2x, manb, manbl, manba, maoa, maob, mapla, maplalc3, maplb, maplblc3, map2, map4, map80, map97, mapk1, mapkap3, mapkkk4, mapt, mar, mark3, mars, masl, maspl, matla, mat2a, mata1, mata2, matk, matn1, matn3, max, maz, mb, mbdl, mb1, mb12, mbp, mbp1, mbs, mbs2, mc1r, mc2r, mc3r, mc4r, mc5r, mcad, mcc, mcdc1, mcdr1, mcf2, mcf3, mcfd1, mch2, mch3, mch4, mch5, mckd, mc1, mc11, mcm, mcm2, mcm2, mcm3, mcm6, mcm7, mcmt, mcop, mcor, mcp, mcp1, mcp3, mcph1, mcr, mcs, mcsf, mcsp, mct1, md1, mdb, mdc, mdcr, mddc, mdeg, mdfl, mdg, mdgl, mdhl, mdh2, mdk, mdk, mdm2, mdm4, mdr1, mdr3, mdrs1, mdrv, mds, mdsl, mdu1, mdu2, mdu3, mdx, mel, me2, mea, mea6, mec 1, mecp2, med, mef, mef2a, mef2b, mef2c, mef2d, mefv, mehmo, meis1, meis2, mekk, mekk1, mekk4, me1, mel18, melf, memo1, men1, men2a, meox1, meox2, mep1a, mep1b, mer2, mer6, mest, met, metrs, mfap1, mfap2, mfap3, mfap4, mfd1, mfi2, mfs1, mfs2, mft, mfts, mg50, mga, mgal, mga3, mgatl, mgat2, mgat5, mgcl, mgcn, mgcr, mgct, mgdf, mgea, mgf, mgi, mgmt, mgp, mgsa, mgst1, mgst2, mhc, mhc2ta, mhp2, mhs, mhs2, mhs3, mhs4, mhs6, mia, mic10, mic11, mic12, mic17, mic18, mic2, mic2x, mic2y, mic3, mic4, mic7, mica, micb, mid1, midas, mif, mif, mig, mip, mip2a, mip2b, mip3b, mipep, mitf, miwc, mjd, mik, mki67, mkks, mkp2, mkp3, mkpx, mks, mks, mksl, mks2, mlal, mlck, mlfl, mlf2, mlh1, mlk1, mlk3, ml1, ml12, ml1t1, ml1t2, ml1t3, ml1t4, ml1t6, ml1t7, mlm, mlm, mln, mlp, mlr, 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ush2a, ush3, usp11, usp5, usp7, usp9x, usp9y, ut1, ut2, ute, utr, utm, utx, uty, uv20, uv24, uvo, vacht, vacm1, vamp1, vamp2, vars1, vasp, vat1, vat2, vav, vav1, vav2, vbch, vbpl, vcaml, vcf, vc1, vcp, vdac1, vdac2, vddl, vdi, vdr, vegf, vegfb, vegfd, vegfr3, vgf, vgl, vgrl, vhl, vhr, vi11, vi12, vim, vip, vipr1, vipr2, vis1, vla1, vla5a, vlacs, vlcad, vldlr, vmat1, vmcm, vmd1, vmd2, vnra, vnt, vp, vpp1, vpp3, vpreb1, vpreb2, vrf, vrk1, vrk2, vmf, vrni, vsn11, vtn, vwf, vws, waf1, wars, was, wbs, wd1, wdr2, wee1, wfrs, wfs, wfs1, wgn1, whcr, wi, wisp1, wisp2, wisp3, wnd, wnt1, wnt10b, wnt13, wnt14, wnt15, wnt2, wnt3, wnt5a, wnt7a, wnt7b, wnt8b, wrb, wm, wsl, ws2a, ws2b, ws4, wsn, wss, wss, wt1, wt2, wt3, wt4, wt5, wts, wts1, wws, x11, xbpl, xbp2, xce, xdh, xe169, xe7, xe7y, xg, xgr, xh2, xiap, xic, xist, xk, xla, xla2, xlp, xlpd, xlrs1, xm, xpa, xpb, xpc, xpcc, xpct, xpf, xpf, xpg, xpmc2h, xpnpep2, xpol, xrccl, xrcc2, xrcc3, xrcc4, xrcc5, xrcc9, xrs, xs, xwnt2, yb1, yes1, ykl40, yl1, yrrm1, yt, ywha1, ywhab, ywhah, ywhaz, yy1, zac, zag, zan, zap70, zf87, zfm1, zfp3, zfp36, zfp37, zfx, zfy, zicl, zic2, zic3, zipk, znf1, znf10, znf117, znf11a, znf11b, znf12, znf121, znf123, znf124, znf125, znf126, znf13, znf14, znf141, znf144, znf146, znf147, znf157, znf16, znf160, znf162, znf163, znf165, znf169, znf173, znf179, znf189, znf19, znf192, znf193, znf195, znf198, znf2, znf20, znf200, znf204, znf217, znf22, znf23, znf24, znf25, znf26, znf27, znf29, znf3, znf2, znf34, znf35, znf6, znf38, znf4, znf40, znf41, znf42, znf44, znf45, znf46, znf5, znf6, znf69, znf7, znf70, znf71, znf72, znf73, znf74, znf75, znf75a, znf75c, znf76, znf77, znf79, znf8, zn80, znf81, znf83, znf9, znfc150, znfc25, znfxy, znt3, znt4, zp3a, zp3b, zpk, zwsl, and zyx.

此外，来自细菌、植物、酵母和哺乳动物（例如小鼠）的基因可与本文提供的微生物一起使用。的非限制性示例大肠杆菌genes include: aarF, aas, aat, abpS, abs, accA, accB, accC, accD, acd, aceA, aceB, aceE, aceF, aceK, ackA, ackB, acnA, acnB, acpD, acpP, acpS, acpX, acrA, acrB, acrC, acrD, acrE, acrF, acrR, acs, ada, add, adhB, adhC, adhE, adhR, adiA, adiY, adk, aegA, aer, aes, agaA, agaB, agaC, agaD, agal, agaR, agaS, agav, agaw, agaz, agp, ahpC, ahpF, aidB, ais, alaS, alaT, alaU, alaV, alaW, alaX, aldA, aldB, aldH, alkA, alkB, alpA, alr, alsA, alsB, alsC, alsE, alsK, alx, amiA, amiB, amn, ampC, ampD, ampE, ampG, ampH, amtB, amyA, ansA, ansB, apaG, apaH, aphA, appA, appB, appC, appY, apt, aqpZ, araA, araB, araC, araD, araE, araF, araG, araH, araj, arcA, arcB, argA, argB, argc, argD, argE, argF, argG, argH, argI, argM, argP, argQ, argR, argS, argT, argU, argv, argw, argx, argY, argz, aroA, aroB, aroC, aroD, aroE, aroF, aroG, aroH, arol, aroK, aroL, aroM, aroP, aroT, arsB, arsC, arsR, artI, artJ, artM, artP, artQ, ascB, ascF, ascG, asd, asiA, asIB, asmA, asnA, asnB, asnC, asnS, asnT, asnU, asnV, asnW, aspA, aspC, aspS, aspT, aspU, aspV, asr, asu, atoA, atoB, atoC, atoD, atoS, atpA, atpB, atpC, atpD, atpE, atpF, atpG, atpH, atpI, avtA, azaA, azaB, azl, bacA, baeR, baeS, barA, basR, basS, bax, bcp, bcr, betA, betB, betI, betT, bfd, bfm, bfr, bglA, bglB, bglF, bglG, bglJ, bglT, bglX, bioA, bioB, bioC, bioD, bioF, bioH, bioP, bipA, birA, bisC, bisZ, blc, bolA, bRNQ, brnR, bmS bmT, btuB, btuc, btuD, btuE, btuR, bymA, cadA, cadB, cadC, cafA, caiA, caiB, caiC, caiD, caiE, caiF, caiT, calA, caiC, calD, can, carA, carB, cbl, cbpA, cbt, cca, ccmA, ccmB, ccmC, ccmD, ccmE, ccmF, ccmG, ccmH, cdd, cde, cdh, cdsA, cdsS, cedA, celA, celB, ceIC, celD, celF, cfa, cfcA, chaA, chaB, chaC, cheA, cheB, cheR, cheW, cheY, cheZ, chpA, chpB, chpR, chpS, cirA, citA, citB, cld, cipA, clpB, clpP, clpX, cls, cmk, cmlA, cmr, cmtA, cmtB, coaA, cobS, cobT, cobU, codA, codB, cof, cog?, corA, cpdA, cpdB, cpsA, cpsB, cpsC, cpsD, cpsE, cpsF, cpsG, cpxA, cpxB, cpxP, cpxR, crcA, crcB, creA, creB, creC, creD, crg, crl, crp, crr, csdA, csgA, csgB, csgD, csgE, csgF, csgG, csiA, csiB, csiC, csiD, csiE, csiF, cspA, cspB, cspC, cspD, cspE, cspG, csrA, csrB, cstA, cstC, cup, cutA, cutC, cutE, cutF, cvaA(ColV), cvaB(ColV), cvaC(Co-lV), cvi(ColV), cvpA, cxm, cyaA, cybB, cybC, cycA, cydA, cydB, cydC, cydD, cynR, cynS, cynT, cynX, cyoA, cyoB, cyoC, cyoD, cyoE, cysA, cysB, cysC, cysD, cysE, cysG, cysH, cysl, cysj, cysK, cysM, cysN, cysP, cysQ, cysS, cysT, cysU, cysW, cysX?, cysZ?, cytR, dacA, dacB, dacC, dacD, dadA, dadB, dadQ, dadX, dam, dapA, dapB, dapD, dapE, dapF, dbpA, dcd, dcm, dcp, dcrB, dctA, dctB, dcuA, dcuB, dcuC, ddIA, ddlB, ddpA, ddpB, ddpC, ddpD, ddpF, ddpX, deaD, dedA, dedD, def, degP, degQ, degS, del, deoA, deoB, deoC, deoD, deoR, dfp, dgd, dgkA, dgkR, dgoA, dgoD, dgoK, dgoR, dgoT, dgsA, dgt, dicA, dicB, dicC, dicF, dinB, dinD, dinF, dinG, dinI, dinY, dipZ, djlA, dksA, dld, dmsA, dmsB, dmsC, dnaA, dnaB, dnaC, dnaE, dnaG, dnaI, dnaj, dnaK, dnaL, dnaN, dnaQ, dnaT, dnaX, dppA, dppB, dppC, dppD, dppF, dppG, dps, dsbA, dsbB, dsbC, dsbG, dsdA, dsdC, dsdX, dsrA, dsrB, dut, dvl, dxs, ebgA, ebgB, ebgc, ebgR, ecfa, eco, ecpD, eda, edd, efp, enirA, emrB, emrD, emrE, endA, eno, entA, entB, entC, entD, entE, entF, envN envP, envQ, envR, envT, envY, envZ, epd, EppA, minigene, EppB, minigene, EppC, minigene, EppD, minigene, EppE, minigene, EppG, minigene, EppH, minigene, era, esp, evgA, evgS, exbB, exbC, exbD, expA, exuR, exuT, fabA, fabB, fabD, fabF, fabG, fabH, fabI, fabZ, fadA, fadB, fadD, fadE, fadH, fadL, fadR, farR, fatA, fbaA, fbaB, fbp, fcl, fcsA, fdhD, fdhE, fdhF, fdnG, fdnH, fdnl, fdoG, fdoH, fdol, fdrA, fdx, feaB, feaR, fecA, fecB, fecC, fecD, fecE, fecI, fecR, feoA, feoB, fepA, fepB, fepC, fepD, fepE, fepG, fes, fexB, ffh, ffs, fhlA, fhlB, fhuA, fhuB, fhiD, fhiE, fhiF, fic, fimA, fimB, fimC, fimD, fimE, fimF, flmG, fimH, fimI, fipB, fipC, fis, fiu, fixA, fixB, fixC, fixX, fklB, fkpA, fldA, flgA, flgB, flgc, flgD, flgE, flgF, flgG, flgH, flgI, flgJ, flgK, flgL, flgM, flgN, flhA, flhB, flhc, flhD, fliA, fliC, fliD, fliE, fliF, fliG, fliH, fliI, flij, fliK, fliL, fliM, fliN, fliO, flip, fliQ, fliR, fliS, fliT, fliy, fliZ, flk, flu, fimt, fnr, focA, focB, folA, foIC, folD, folE, folK, folP, foIX, fpr, frdA, frdB, frdc, frdD, frr, fruA, fruB, fruK, fruR, fsr, ftn, ftsA, ftsE, ftsl, ftsJ, ftsK, ftsL, ftsN, ftsQ, ftsW, ftsX, ftsY, ftsZ, fucA, fucI, fuc, fucO, fucP, fucR, fumA, fumB, fumC, fur, fusA, fusB, gabC gabD, gabP, gabT, gadA, gadB, gadR, galE, galF, galK, gaiM, galP, gaiR, galS, galT, galU, gapA, gapC, garA, garB, gatA, gatB, gatC, gatD, gatR, gatY, gatz, gcd, gcl, gcpE, gcvA, gcvH, gcvP, gcvR, gcvT, gdhA, gef, ggt, gidA, gidB, gip, glcB, glcC, glcD, glcE, glcG, gldA, glf, glgA, glgB, glgC, glgP, gigS, glgX, glk, glmM, gimS, glmU, glmX, glnA, glnB, glnD, glnE, glnG, glnH, glnK, glhL, glnP, glnQ, glnR, glnS, glnT, glnU, glnV, glnW, glnX, gloA, glpA, glpB, glpC, glpD, gipE, gipF, gipG, glpK, glpQ, gipR, gIpT, glpX, gltA, gltB, gltD, gltE, gltF, gltH, gltJ, gltK, gltL, gltM, gltP, gltR, gltS, gltT, gltU, gltv, gltW, gltX, glyA, glyQ, glyS, glyT, glyU, glyv, glyW, glyX, glyY, gmd, gmk, gmm, gnd, gntK, gntp, gntR, gnts, gntT, gntU, gntV, goaG, gor, gph, gpmA, gpp, gprA, gprB, gpsA, gpt, greA, greB, groL, groS, grpE, grxA, grxB, grxC, gshA, gshB, gsk, gsp, gsp*, gst, guaA, guaB, guaC, gurB, gurC, gutM, gutQ, gyrA, gyrB, hcaB, hcaC, hcaD, hcaE, hcaF, hcaR, hcaT, hdeA, hdeB, hdeD, hdhA, helD, hemA, hemB, hemC, hemD, hemE, hemF, hemG, hemH, hemK, hemL, hemM, hemX, hemY, hepA, het, hflB, hflc, hflK, hflx, hfq, hha, hipA, hipB, hisA, hisB, hisC, hisD, hisF, hisG, hisH, hisI, hisJ, hisM, hisP, hisQ, hisR, hisS, hipA, hlyE, hmp, hns, holA, holB, hoIC, holD, holE, hopB, hopC, hopD, hpt, hrpA, hrpB, hrsA, hscA, hscB, hsdM, hsdR, hsdS, hslC, hslD, hslE-H, hslJ, hslK, hsIL-N, hslO-R, hslU, hslV, hslW, htgA, htpG, htpX, htrB, htrC, htrE, htrL, hupA, hupB, hyaA, hyaB, hyaC, hyaD, hyaE, hyaF, hybA, hybB, hybC, hybD, hybE, hybF, hybG, hycA, hycB, hycC, hycD, hycE, hycF, hycG, hycH, hycI, hydA, hydG, hydH, hydN, hyfA, hyfB, hyfC, hyfD, hyfE, hyfF, hyfG, hyfH, hyfI, hyfJ, hyfR, hypA, hypB, hypc, hypD, hypE, hypF, iadA, iap, ibpA, ibpB, icd, icIR, ihfA, ihfB, ileR, ileS, ileT, ileU, ileV, ileX, ileY, ilvA, ilvB, ilvC, ilvD, ilvE, ilvF, ilvG, ilvH, ilvI, ilvJ ilvM, ilvN, ilvR, ilvU, ilvY, imp, inaA, inaR, infA, infB, infc, inm, insA(IS1), intA, isb(IS1), isfA, ispA, ispB, KanR, katE, katG, kba, kbl, kch, kdgK, kdgR, kdgT, kdpA, kdpB, kdpC, kdpD, kdpE, kdpF, kdsA, kdsB, kdtA, kdtB, kefB, kefC, kgtp, ksgA, ksgB, ksgc, ksgD, lacA, lacI, lacY, lacZ, lamB, lar, ldcC, ldhA, lepA, lepB, leuA, leuB, leuC, leuD, leuj, leuO, leuP, leuQ, leuR, leuS, leuT, leuU, leuV, leuW, leuX, leuY, leuZ, lev, lexA, lgt, lhr, ligA, ligT, linB, lipA, lipB, lit, livF, livG, livH, livJ, livK, livM, lldD, lldP, lldR, lolA, lon, lpcA, lpcB, lpd, iplA, lpp, lpxA, lpxB, lpxC, lpxD, lpxK, lrb, lrhA, lrp, lrs lspA, lysA, lysC, lysP, lysQ, lysR, lysS, lysT, lysU, lysV, lysW, lysX, lysY, lysZ, lytA, lytB, lyx, maa, mac, mae, mafA, mafB, malE, malF, maIG, malI, malK, malM, malP, malQ, malS, malT, maIX, malY, malZ, manA, manC, manX, manY, manZ, map, marA, marB, marR, mbrB, mcrA, mcrB, mcrC, mcrD, mdaB, mdh, mdoB, mdoG, mdoH, meb, melA, melB, meIR, menA, menB, menC, menD, menE, menF, mepA, mesj, metA, metB, metC, metD, metE, metF, metG, metH, metj, metK, metL, metR, metT, metU, metV, metW, metY, metZ, mfd, mglA, mglB, mglC, mglR, mgsA, mgtA, mhpA, mhpB, mhpC, mhpD, mhpE, mhpF, mhpR, miaA, miaD, micF, minC, minD, minE, mioC, mltA, mltB, mltC, mltD, mmrA(rhlB), mng, mntA, moaA, moaB, moaC, moaD, moaE, mobA, mobB, moc, modA, modB, modC, modE, modF, moeA, moeB, mog, moIR, motA, motB, mpl, mppA, mprA, mraA, mraY, mrcA, mrcB, mrdA, mrdB, mreB, mreC, mreD, mrp, mrr, msbA, msbB, mscL, msrA, msyB, mtg, mtgA, mtlA, mtlD, mtlR, mtr, mttA, mttB, mttC, mukB, mukE, mukF, mul, murA, murB, murC, murD, murE, murF, murG, murH, murI, mutG(putative), mutH, mutL, mutM, mutS, mutT, mutY, nac, nadA, nadB, nadC, nadE, nagA, nagB, nagc, nagD, nagE, nalB, nalD, nanA, nanE, nanK, nanR, nanT, napA, napB, napC, napD, napF, napG, napH, narG, narH, narI, narj, narK, narL, narP, narQ, narU, narV, narW, narX, narY, narZ, ndh, ndk, neaB, nei, nemA, nfi, nfnA, nfnB, nfo, nfrA, nfrB, nfrD, nfsA, nhaA, nhaB, nhaR, nikA, nikB, nikC, nikD, nikE, nirB, nirC, nirD, nlpA, nlpB, nlpC, nlpD, nmpC(qsr′), non, npr, nrdA, nrdB, nrdD, nrdE, nrdF, nrdG, nrfA, nrfB, nrfC, nrfD, nrfE, nrff, nrfG, nth, ntpA, nuoA, nuoB, nuoC, nuoE, nuoF, nuoG, nuoH, nuoI, nuoJ, nuoK, nuoL, nuoM, nuoN, nupC, nupG, nusA, nusB, nusG, nuvA, nuvC, ogrK, ogt, ompA, ompC, ompF, ompG, ompR, ompT, ompX, oppA, oppB, oppC, oppD, oppE, oppF, opr, ops, oraA, ordL, orf-23(purB, reg)orfl95(nikA-reg), orn, osmB, osmC, osmE, osmY, otsA, otsB, oxyR, oxyS, pabA, pabB, pabC, pac, pal, panB, panC, panD, panF, parC, parE, pat, pbpG, pck, pcm, pcnB, pdhR, pdxA, pdxB, pdxH, pdxj, pdxK, pdxL, pdxY, pepA, pepD, pepE, pepN, pepP, pepQ, pepT, pfkA, pfkB, pflA, pflB, pflC, pflD, pfs, pgi, pgk, pgl, pgm, pgpA, pgpB, pgsA, pheA, pheP, pheS, pheT, pheU, pheV, phnC, phnD, phnE, phnF, phnG, phnH, phnI, phnJ, phnK, phnL, phnM, phnN, phnO, phnP, phoA, phoB, phoE, phoH, phoP, phoQ, phoR, phoU, phrB, phxB, pin, pioO, pit, pldA, pldB, plsB, plsC, plsX, pmbA, pncA, pncB, pnp, pntA, pntB, pnuC, poaR, polA, polB, popD, potA, potB, potC, potD, potE, potF, potG, potH, potl, poxA, poxB, ppa, ppc, pphA, pphB, ppiA, ppiB, ppiC, ppk, pppA, pps, ppx, pqiA, pqiB, pqqL, pqqM, prc, prfA, prfB, prfC, priA, priB, priC, prIC, prlZ, prmiA, prmB, proA, proB, proC, proK, proL, proM, prop, proQ, proS, proT, proV, proW, proX, prpA, prpC, prpR, prr, prs, psd, psiF, pspA, pspB, pspC, pspE, pspF, pssA, pssR, pstA, pstB, pstC, pstS, psu, pta, pth, ptrA, ptrB, ptsG, ptsH, ptsI, ptsN, ptsP, purA, purB, purC, purD, purE, purF, purH, purK, purL, purM, purN, purP, purR, purT, purU, pus, putA, putP, pykA, pykF, pyrB, pyrC, pyrD, pyrE, pyrF, pyrG, pyrH, pyrl, qmeC, qmeD, qmeE, qor, queA, racC, racR, radA, radC, ranA, rarD, ras, rbfA, rbn, rbsA, rbsB, rbsC, rbsD, rbsK, rbsR, rcsA, rcsB, rcsC, rcsF, rdgA, rdgB, recA, recB, recC, recD, recE, recF, recG, recj, recN, recO, recQ, recR, recT, relA, relB, relE, relF, relX, rep, rer, rfaB, rfaC, rfaD, rfaF, rfaG, rfaH, rfaI, rfaj, rfaK, rfaL, rfaP, rfaQ, rfaS, rfay, rfaZ, rfbA, rfbB, rfbC, rfbD, rfbX, rfc, rfe, rffA, rffC, rffD, rffE, rffG, rffH, rffM, rffT, rhaA, rhaB, rhaD, rhaR, rhaS, rhaT, rhIB, rhIE, rho, ribA, ribB, ribC, ribD, ribE, ribF, ridA, ridB, rimB, rimC, rimD, rimE, rimG, rimH, rimI, rimJ, rimK, rimL, rimM, rit, rlpA, rlpB, rluA, rluC, rluD, rmf, ma, mb, mc, rnd, rne, mhA, nrhB, rnk, mpA, mpB, rnr, mt, rob, rorB, rpe, rph, rpiA, rpiB, rpiR, rplA, rplB, rplC, rplD, rplE, rplF, rpI, rplJ, rplK, rplL, rplM, rplN, rplO, rplP, rplQ, rplR, rplS, rplT, rplU, rplV, rplW, rplX, rplY, rpmA, rpmB, rpmC, rpmD, rpmE, rpmF, rpmG, rpmH, rpml, rpmj, rpoA, rpoB, rpoC, rpoD, rpoE, rpoH, rpoN, rpoS, rpoZ, rpsA, rpsB, rpsC, rpsD, rpsE, rpsF, rpsG, rpsH, rpsl, rpsJ, rpsK, rpsL, rpsM, rpsN, rpsO, rpsP, rpsQ, rpsR, rpsS, rpsT, rpsu, rrfA, rrfB, rrfC, rrff), rrfE, rrff, rrfG, rrfH, rrlA, rrlB, rrlC, rrlD, rrlE, rriG, rrlH, rrmA, rrsA, rrsB, rrsC, rrsD, rrsE, rrsG, rrsH, rsd, rseA, rseB, rseC, rspA, rspB, rssA, rssB, rsuA, rtcA, rtcB, rtcR, rtn, rus(qsr′), ruvA, ruvB, ruvC, sad, sanA, sapA, sapB, sapC, sapD, sapF, sbaA, sbcB, sbcC, sbcD, sbmA, sbmC(gyrI), sbp, sdaA, sdaB, sdaC, sdhA, sdhB, sdhC, sdhD, sdiA, sds, secA, secB, secD, secE, secF, secG, secY, selA, selB, seIC, selD, semA, seqA, serA, serB, serC, serR serS, serT, serU, serV, serW, serX, sfa, sfcA, sfiC, sfsA, sfsB, shiA, sipC, sipD, sir, sixA, sloB, slp, slr, slt, slyD, slyX, smp, smtA, sodA, sodB, sodC, sohA, sohB, solA, soxR, soxS, speA, speB, speC, speD, speE, speF, speG, spf, spoT, sppA, spr, srlA, sriB, sriD, srlE, srlR, srmB, srnA, ssaE, ssaG, ssaH, ssb, sseA, sseB, sspA, sspB, ssrA, ssrS, ssyA, ssyD stfZ, stkA, stkB, stkC, stkD, stpA, strC, strM, stsA, sucA, sucB, sucC, sucD, sufI, sugE, suhA, suhB, sulA, supQ, surA, surE, syd, tabC, tag, talA, talB, tanA, tanB, tap, tar, tas, tauA, tauB, tauC, tauD, tbpA, tdcA, tdcB, tdcC, tdcD, tdcE, tdcF, tdcG, tdcR, tdh, tdi tdk, tehA, tehB, tesA, tesB, tgt, thdA, thdc, thdD, thiB?, thiC, thiD, thiE, thiF, thiG, thiH, thiI, thij, thiK, thiL, thiM, thrA, thrB, thrc, thrS, thrT, thru, thrV, thrw, thyA, tig, tktA, tktB, tidD, tInA, tmk, tnaA, tnaB, tnaC, tnm, tol-orf1, tol-orf2, tolA, tolB, toiC, tolD, tolE, tolI, toiJ, tolM, tolQ, toIR, tonB, topA, topB, torA, tor C, torD, tor R, tor S, torT, tpiA, tpr, tpx, treA, treB, treC, treF, treR, trg, trkA, trkD, trkG, trkH, trmA, trmB, trmc, tnnD, trmE, trmF, trmH, trmU, trnA, trpA, trpB, trpc, trpD, trpE, trpR, trps, trpT, truA, truB, trxA, trxB, trxc, tsaA, tsf, tsmA, tsr, tsx, ttdA, ttdB, ttk, tufA, tuffB, tus, tynA, tyrA, tyrB, tyrp, tyrR, tyrS, tyrT, tyrU, tyrV, ubiA, ubiB, ubiC, ubiD, ubiE, ubiF, ubiG, ubiH, ubiX, ucpA, udk, udp, ugpA, ugpB, ugpC, ugpE, ugpQ, uhpA, uhpB, uhpC, uhpT, uidA, uidB, uidR, umuC, umuD, ung, upp, uppS, ups, uraA, usg-1, usbA, uspA, uup, uvh, uvrA, uvrB, uvrC, uvrD, uvs, uxaA, uxaB, uxaC, uxuA, uxuB, uxuR, valS, valT, valU, vaIV, valW, vaIX, valY, vaIZ, vsr, wrbA, xapA, xapB, xapR, xasA, xerC, xerD, xni, xseA, xseB, xthA, xylA, xylB, xylE, xylF, xylG, xylH, xylR, yccA, yhhP, yihG, yjaB, fl47, yjaD, yohF, yqiE, yrfE, zipA, zntA, znuA, znuB, znuC, zur, and zwf.

Ejemplos de genes de Camundong restringidos son: Ilr1, Ilr2, Gas10, Tnp1, Inhbb, Inha, Creb1, Mpmv34, Acrd, Acrg, Il110, Otfl, Rab11b-r, Abl1, ald, Amh-rs1, Bc12B, CchIla3, Ccnb1 - rs2、Gpcr16、Htr5b、IddS、Igfbp2、Igfbp5、Il8rb、Kras2-rs1、Mov7、Mpmv6、Mpmv16、Mpmv22、Mpmv25、Mpmv29、Mpmv42、Mtv7、Mtv27、Mtv39、Oprk1、Otf3-rs1、Otf8、Otf11-rs1 , Renl, Ren2, R113, Sxv, Taz4-rs1, Tgfb2, Wnt6, Xmmv6, Xmmv9, Xmmv36, Xmmv61, Xmmv74, Xmv21, Xmv32, Xmv41, I12ra, Ab, Mpmv3, Rapla-ps2, anx, Mpmv43, Ryr3, Ras12 -4、Adra2b、Avp、Glvrl、IIIa、IIIb、Mpmv28、Oxt、Pcsk2、a、Xmv10、Tcf4、Acra、Acra4、Ak1、Bdnf、bs、Cyct、Cyp24、Dbh、Fshb、Gcg、Gdf5、Gnas、Gpcr8 , Grin1, Hcs4, Hior2, Hsp84-2, Idd12, Ilrn, Jund2, Kras3, Mc3r, Mpmv14, Mtv40, Mxi1-rs1, Otf3-rs2, Ptgs1, Ptpra, Rapsn, Src, Svpl, Svp3, Tcf3b, Wt1, Xmmv71 , Xmv48, Ccna, Fgf2, Fth-rs1, Csfim, Mov10, Egf, Acrb2, Cap1, Crh, Fim3, Fps11, Glut2, Gpcr2, Gria2, Hsd3b-1, Hsd3b-2, Hsd3b-3, Hsd3b-4, Hsp86 -ps2、Idd3、112、117、Mpvmv9、Mpmv20、Mtv4.8、Ngfb、Npra、Nras、Nras、Ntrk、Otf3-rs3、Otf3-rs4、Rapla、Tshb、Xmmv22、Xmmv65、Mos、Ras1​​2-7、Lyr Ifa、Ifb、Jun、azh、db、Ipp、Mp1、Do1、Ak2、Ccnb1-rs4、Cdc211、Cga、Fgr、Foc1、Fps12、Gabrr1、Gabrr2、Gdf6、Glut1、Gnb1、Gpcr14、Grb2-ps、Grik3、 Grik5、Hsp86-lps4、Htrlda、Htrldb、Idd9、Ifa1、Ifa2、Ifa3、Ifa4、Ifa5、Ifa6、Ifa7、Ifa8、Ifa9、Ifa10、Lap18、Lmycl、Mpmv19、Mpmv44、Mtv13、Mtv14、Mtv17、Nppb、Otf6、 Otf7、R112、Esquí、Tnfr2、Wnt4、Xmmv8、Xmmv23、Xmmv62、Xmv1、Xmv2、Xmv8、Xmv9、Xmv14、Xmv44、Xpa、Tec、Fgf5、Nosl、Tcfl、Epo、Gnb2、Flt1、Flt3、Ache、Adra2c Adrbk2 Afp Albl Ccnb1-rs1 Reloj Cyp3 Cyp3a11 Cyp3a13 Drd1b Drd5 Fgfr3 Flk1 Gc Gnrhr Gpcr1 Hcs5 Hnf1 Htr5a I15r I16 Kit Ltrm3 Mgsa，Mpmv7，Mpmv13，Mpmv23，Mtv32，Mtv41，Pdgfa，Xv，Xmm，Xmmd，5，Por , Xmm5 Xmv17, Xmv28, Xmv34, Xmv38, Xmv45, Zp3, Trh, Raf1, Fth-rs2, Ntf3, Kras2, Pthlh, Mov1, Alox5, Braf2, Cftr, Egr4, Fpsl10, Fgf6, Gdf3, Ghrfr, Glut3, Grin2a, Hior3、Hoxa10、啤酒花、Ica1、I15r、Int41、Itpr1、Krag、Mad、Met、Mi、Mtv8、Mtv23、Mtv29、Mtv33、Mtv34、Nkna、Npy、Ob、Otf3-rs5、Tgfa、Tnfr1、Wnt2、Wnt5B、 Wnt7A, Xmmv27, Xmv24, Xmv61, Fosb, Ryr1, Ngfa, Ufo, Xrccl, Abpa, Abpga, Gabra4, Gas2, Acra7, Ccnb1-rs7, Egfbp3, Xmv30, Zp2, Fes, Pcsk3, Calc, Ccnb1-rs10, Pth, Ad、Bcl3、Cea、Cea2、Cea3、Cea4、Cea5、Cea6、Cebp、Dm9、Dm15、Drd4、Egfbp1、Egfbp2、Ercc2、Fgf3、Fgfr2、Gabra5、Gabrb3、Gtx、Hcs1、Igflr、Igf2、I14r、 Ins2、Int40、Lhb、Mpmv1、Mty1、Mtv35、Ngfg、Ntf5、Otf2、2、Pkcc、Ras1​​4、Rras、Ryr、Svp2、Tcfg、Tgfb1、Banheira、Xmmv31、Xmmv35、Xmmv73、Xmv33、Xmv53、Taz83、Adrb3、 Junb、Jundl、MeI、Gpcr19-rs2、Agt、Cadp、Ccnb1-rs9、E、Fgfr1、Gas6、Gnb-rs1、Hcs2、Insr、Maf、Mov34、Mpmv21、Mpmv41、Mtv21、Mtnrla、Plat、Ras1​​5-2、 Ras16、Sntb2、Xmmv29、Xmv12、Xmv26、Xmv62、Epor、Gpcr13、Otf11、Pthr、Acra3、Acra5、Acrb4、Camk1、Cdc25Mm、Crbp、Crbp2、Csk、Cyp11a、Cyp19、Drd2、Etsl、Fli1、Gnai2、Gnat1、 Gpcr6、Gria4、Hgf1、Hior1、Hpx、Hsp86-lps3、Hst2、Idd2、I11bc、Lag-rs1、Lap18-rs1、M11、Mpmv27、Penk、Pgr、Ras1​​2-2、Tp11、Trf、Xmmv2、Xmmv67、Xmv15、 Xmv16, Xmv25, Xmv60, Mgf, Amh, Braf, Cdc2a, Dmdl, Estr, Fps13, Fps14, Fps15, Gli, Gpcr17, Grik2, Ifgr, Igf1, Mpmv5, Mpmv12, Mpmv40, Myb, Oprm, Pg, PMCH, Ros1, Xmv31, Xmv51, Xmv54, Camk2b, Egfr, Int6, Lif, Mtv44, Ews, Csfgm, Flt4, I13, I14, I15, Irf1, Gria1, Glut4, Crhr, Csfg, Mov9, Xmv20, Acrb, Mpmv4, Mpmv15, Ngfr, Nos2, Rara, Taz4, Tcf2, Xmv42, Mtv3, Adral, Crko, df, Erbb2, Gabra1, Gabra6, Gabrg2, Gh, Glra1, Grb2, Hnflb, Hsp86-ps1, Idd4, Igfbp1, Igfbp3, I113, Int4, Mpmv2, Mpmv8, Mpmv18, Mtv45, nu, Pkca, Rab1, Re1, Shbg, Tcf7, Thra, Tnz1, Trp53, Wnt3, Wnt3A, Xmv4, Xmv5, Xmv47, Xmv49, Xmv63, Akt, Amh-rs4, Ccs1, Fps16, Fos, Gdf7、Hcs3、Hsp70-2、Hsp84-3、Hsp86-1、hyt、Ltrm1、Max、Mpmv11、Mpmv24、Mtv9、Mtv30、Pomc1、Tcf3a、Tda2、Tgfb3、Tpo、Tshr、Xmmv21、Xmmv25、Xmmv34、Xmmv50、 Gli3、Xmv55、Ryr2、Inhba、Gasl、Pcsk1、Amh-rs2、Ccnb1-rs6、Ccnb1-rs13、Crhpb、Dat1、Drd1a、Fgfr4、Fps17、Fiml、Gpcr15、Gpcr18、Hbvi、Hilda、Htrla、Iddl1、I19、 Ltrm4, Mak, mes, P1, P12, Pr1, Ra1, Rasa, Srd5a1, Tpbp, Xmv13, Xmv27, Rarb, Rbp3, Htr2, Rb1, Acra2, Camkg, Cch11a2, Ccnb1-rs5, CcnbI-rs12, Gnrh, Mty11, Nras-ps、Otf3-rs6、Plau、Ptprg、Trp53-ps、Wnt5A、Xmv19、Ghr、I17r、Lifr、Mlvi2、Prlr、Myc、R111、Gear、Amh-rs7、I12rb、Pdgfb、Acr、CP2、Rarg、 Spl-1、Wnt1、Afr1、Atf4、Bzrp、Ccnb1-rs11、Cyp11b、I13rb1、I13rb2、Ins3、Itga、Mlvi1、Mlvi3、Mtv36、Pdgfec、Svp5、Tef、Trhr、Wnt7B、Xmmv55、Xmmv72、Xmv37、Tnp2、 Ets2, Casr, Chuck-rs1, din, Drd3, Erg, G22p1, Gap43, Gas4, Grik1, Htrlf, Ifgt, Int53, Ltrm2, Mpmv17, Mtv6, Mtvrl, Pit1, Xmv3, Xmv35, Xmv50, Igf2r, Mas, Tcd3, Glplr、Iddl、Tla、Aegl、Ccnb1-rs3、Cdc2b、Csi、Cyp21、Cyp2'-psl、Fps18、Gna-rs1、Gpcr19-rs1、Grr1、Grr2、Homl、Hsc70t、Hsp70、Hsp70-1、Hsp70-3 , Hsp84 -1, Hst1, Hst4, Hst5, Hst6, Hye, Int3, Itpr3, Lap18-rs2, Otf3, Ptprs, Rab11b, Ras12-1, Ras12-3, Ras13, Rrs, Rxrb, Tas, Tcd1, Tcd2, Teral , Tla-rs, Tnfa, Tnfb, Tpx1, Tpx2, Xmmv15, Xmv36, Xmv57, Csfimr, Pdgfrb, Adrb2, Apc, Camk2a, Camk4, Dcc, Fgfl, Gna1, Gpcr7, Grl1, Grp, Hsp74, Mcc, Mtv2, Mtv38 , Ptpn2, Tp12, Xmv22, Xmv23, Xmv29, Fth, Csfgmra, Mxi1, Adra2a, Adrbl, Adrbk1, Chuck, Cyp17, Gna14, Gnb-psl, Hcs6, Htr7, Ide, Ins1, Lpc1, Pomc2, Seao, Tlx1, Xmmv42 , Xmv18, Tcfe3, Araf, Avpr2, mdx, Ar, Zfx, Otf9, Ccg1, Ccnb1-rs8, Fps19, Gabra3, Glra2, Glra4, Gria3, Grpr, Hsp74-psl, Hst3, Htr1c, I12rg, Mov14, Mov15, Mtv28 , Otf3 -rs8, Sts, Sxa, Sxr, Xta, Tdy, Hya, Zfy1, Zfy2, Mov15, Mov24, Mtv31, Mtv42, Sdma, Spy, Sts, Sxa, Sxr, XmmvY, Xmv7, Xmv 11 y Xmv40。

的非限制性示例菜豆os-Gene umfassen: Acc, as, Adk, Am, Amv-1, Amv-2, Ane, aph, Arc, Are, arg, Ar1 (Arc), asp, B, bc-u, bc-1 1 , bc -1²、bc-2¹、bc-2²、bc-3、Bcm、Beg、Bip、blu、Bpm、Bsm、By-1、By-2、C、C/c、ccr、Ccir、Cma（M、Rma ), Cr, Cres, Crho, C st, [C st R Acc] (Aeq), cu (inh, d. h. e), [c u Prp i ] (Prp, c .ui, Nud), [cuprpst] (prpst) , [C Prp] (Prp), cv, [C R] (R), [C r ] (r), Ca, Cam, Cav, cc, ch1, c1, cm1, Co-1 (A), Co-2 (Eres), Co-3 (Mexique 1), Co-3 2, Co-4 (Mexique 2), Co-5 (Mexique 3), Co-6, Co-7, cr-1 cr-2, llorar, cs、Ct、ctv-1、ctv-2、cyv（by-3）、D（Can、Ins）、Da、Db、def、dgs（gl、le）、dia、Diap-1、Diap-2、diff、 dis，D1-1 D1-2（DL 1 DL）。 2), do, ds (te), dt-1a dt-2a, dt-1b dt-2b, dw-1 dw-2, Ea Eb, ers (restr), ers-2, Est-1, Est-2 , exp, F, Fa, rápido, Fb Fc, fa fb fc, Fcr, Fcr-2, fd, Fe-1 Fe-2, Fin (em), Fop-1, Fop-2, Fr, Fr-2, G（Flav、Ca、Och）、Ga、Gas、glb、Gpi-c1、Gr、Hbl (LHB-1)、Hbnc (SCHB-1)、Hbp (PDHB-1)、hmb、Hss、Hsw、Ht- 1, Ht-2 (L-1, L-2), I, Ia, Ib, ian-1 ian -2 (ia), lbd, ico, Igr (Ih), ilo, ip, iter, iv, iw, J (Sh)、Ke、L、la、Lan、Ld、Lds (Ds)、Lec、Li (L)、lo、Ir-1 lr-2、mar、Me、Mel (Me)、Mel-2 (Me -2), Mel-3 (me-3), Mf, mi, mia, Mic (Mip), miv, Mrf, Mrf 2, mrf, ms-1, Mue, mu mutator, Nag, Nd-1 Nd-2 (D-1 D-2), nie, nnd (sym-1), nnd-2, Não, nts (aceno), Nudus, ol, P, p.sup.gri (Gri, v.sup.Pal), pa、pc、pg (pa.sub.1)、Pha、Pmv、ppd (neu)、Pr、prc (pc)、Prx、punc、ram、Rbcs (rbcS)、rf-1、rf-2、rf- 3, rfi (i), Rfs (m), Rk, rk, rk d (lin), rn-1 rn-2 (r r), rnd, Ro, Sal, sb, sb.sup.ms, sb-2, sb-3, sil, Skdh, s1, Smv, St, Sur, sw-1 sw-2, T, t (z-1), Th-1 Th-2, Tm, To, Tor (T), Tr,三、trv、Ts、tw、uni、Uni-2、uni.sup。 nde, uninie, Ur-1, Ur-2, Ur-2 2, Ur-3 (Ur-3, Ur-4), Ur-3 2, Ur-4, (Up-2, Ur-C), Ur -5, (B-190), Ur-6 (Ura, Ur-G), Ur-7 (RB11), Ur-8 (Arriba - 1), Ur-9 (Urp), nosotros, V (B1), vlae (Cor), v, var, vi (virf), wb, Wmv, X. sup.su, y e Z.

的非限制性示例酿酒酵母OS-Gene umfassen: PRE3, PUP1, PUP3, PRE2, PRE10, PRE1, PRE8, SCL1, PUP2, PRE5, PRE7, PRE4, RPT2, RPT3, RPN3, RPN11, RPN12, RPT6, RPN1, RPN2, RPT1, RPT5, RPT4 , SKI6, RRP4, DIS3, TSC10, RAT1, GND1, EXO70, ERG10, ACC1, RPPO, ACTi, ARP100, ARP3, PANI, ARP2, ARP4, ARP9, SPE2, CYR1, ALA1, TPS1, TUB1, ABF1, DED81, NIP1 , YHCl, SNU71, ATM1, MAK5, ROK1, DED1, SPB4, AUR1, PSE1, ALG1, TUB2, BPL1, MSL5, ERG24, ERG26, ERG25, CMD1, HCA4, SHE9, SHE10, CAK1, PIS1, CHO1, CDS1, ESR1 , NUD1, CDC47, CDC13, CDC37, CDC1, CDC4, CDC20, CDC6, CDC46, CDC3, KAR1, BBP1, HRP1, CCT2, CCT3, HSP10, SMC1, SMC2, CHCl, CFT2, CLP1, COP1, SEC26, SEC27, RET2 , SEC21, COF1, CCT4, CCT1, CCT6, SEC24, SEC7, PCF11, RNA15, RNA14, FIP1, YSH1, TFB4, TSM1, APC2, APC5, SEC31, TAF47, TAP42, MPP10, CDC53, CKS1, CDC28, KIN28, CNS1 , ERG11, DBP10, DBP8, PRO3, DYS1, ALR1, TID3, DNA2, SSL2, RAD3, RFA3, RFA2, RFA1, RFC4, RFC5, RFC3, RFC2, RFC1, TOP2, RAP1, RPC25, PR12, PR11, POL1, POL12 , HUS2, CDC2, POL2, DPB2, RPB10, RPA135, RPA190, RPA43, RPB8, RPO26, RPB5, RPC40, RPC19, SRB7, SRB4, RGR1, RPB11, SRB6, RPB2, RPB7, RPO21, RET1, RPO31, RPC31, RPC34 , RPC53, RPC82, RPB12, RPB3, DPM1, DIP2, RNT1, CDC8, CDC14, DUT1, UBA2, UBA1, UBC9, CDC34, ENPI, ERD2, SSS1, SEC61, SEC63, SEC62, GNA1, GPI8, DAM1, DUO1, IRR1 , PRP3, TIM9, HSH49, SUP35, EXM2, MEX67, ERG9, ERG20, FAS2, FAS1, NOP1, FAD1, AOS1, FBA1, NCB2, BRN1, TUB4, GDI1, GOG5, SRM1, CDC25, SPT16, YIF2, BET4, CDC43 , MRS6, BET2, PRO1, GLN1, GLN4, GRS1, YIP1, FOL2, GPA1, CDC42, SAR1, YPT1, SEC4, GSP1, TEM1, RHO1, CDC24, RNA1, GUK1, VMA16, PMA1, HKR1, SIS1, MGE1, HSP60 , HSF1, HAS1, MOT3, HTS1, ESA1, HSL7, HOM6, RIB7, SLY1, CSL4, PUR5, CSE1, IPP1, MDM1, USO1, SOF1, MAK11, LAS1, TEL2, DPB11, SGD1, FAL1, MTR3, MTR4, SPP2 , SIK1, RRP7, POP4, RRP1, POP3, BFR2, CDC5, NRD1, MET30, MCM6, RRP46, SAS10, SCC2, ECO1, PRP43, BET3, BET5, STN1, NFS1, IDI1, SRP1, KAP95, CBF2, SKP1, CEP3 , CTF13, ERG7, KRS1, PSA1, PMI40, ALG2, SSF1, MED7, RSC4, CDC54, MCM2, AFG2, ERG12, MVD1, CDC48, MHP1, ERV1, SSC1, TIM44, TIM17, TIM23, TOM22, TOM40, MAS1, MCD1 , MMC1, STU1, JAC1, ABD1, CEG1, PAB1, MTR2, SEC16, ROT1, INO1, MLC1, MYO2, GPI2, SPT14, NAT2, NMT1, TRM1, NCP1, NBP1, ACF2, SPP41, NUT2, LCP5, PRP19, NMD3 , RFT1, NNF1, NDC1, CRM1, KAR2, NIP29, NAB2, NIC96, NUP145, NUP49, NUP57, NUP159, NSP1, NUP82, CDC39, NPL4, POP7, NTF2, MAK16, NPL3, NOP2, NOP4, NHP2, NOP10, GAR1 , NBP35, WBP1, STT3, SWP1, OST2, OST1, ORC1, ORC6, ORC5, ORC4, ORC3, RRR1, SAT2, PWP2, PEX3, TOR2, PIK1, SEC14, STT4, MSS4, PCM1, GPM1, SEC53, ERG8, YPD1 , PAP1, NAB3, RRN7, SEN1, CFT1, PRP11, PRP21, PRP39, PRP24, PRP9, SLU7, PRP28, PRP31, IFH1, PTA1, SUB2, FMI1, MAS2, ESS1, PFY1, POL30, POP1, PDI1, RAM2, CDC7 , SMP3, CDC15, YTH1, QR12, YAE1, SFI1, SEC1, BET1, SEC6, SEC13, SEC2, SEC8, CBF5, CDC19, YRB1, RHC18, DBF4, SDS22, MCM3, CEF1, ALG11, GAA1, MOB1, NIP7, TIP20 , SEC5, SEC10, GPI10, RRP3, CDC45, DIB1, MIF2, HOP2, PBN1, NOP5, RPP1, POP5, POP8, POP6, ERO1, MPT1, DNA43, ESP1, SMC3, LST8, STS1, RPM2, RNR1, RNR2, RNR4 , RPS20, RPL25, RPL3, RPL30, RPL32, RPL37A, RPL43A, RPL5, RPL10, RPS3, CET1, YRA1, SNM1, GLE1, DBP5, DRS1, DBP6, BRR2, RRN3, RRN6, RRN11, MED6, PRP16, RPR2, DIM1 , RRP43, RRP42, RRP45, SEC20, BOS1, CDC12, GLC7, PKCl, IPL1, SGV1, NRK1, RAD53, LCB2, LCB1, MPS1, SES1, SPC3, SEC11, RIO1, ARP7, NEO1, YJU2, POB3, ARH1, IQG1 , HRT1, HYM1, MAK21, FUN20, FUN9, NBN1, STB5, YIF1, SMX4, YKT6, SFT1, SMD1, PRP6, LSM2, NUF1, SPC97, SPC42, SPC98, CDC31, SPC19, SPC25, SPC34, SPC24, NUF2, PRP40 , MCD4, ERG1, SMC4, CSE4, KRR1, SME1, TRA1, RLP7, SCH9, SMD3, SNP2, SSF2, SPC72, CDC27, CDC23, CDC16, APC1, APC11, APC4, ARC19, RPN6, RPN5, RSC6, RSC8, STH1 , SFH1, TIM12, TIM22, TIM10, SQT1, SLS1, JSN1, STU2, SCD5, SSU72, ASM4, SED5, UFE1, SYF1, SYF2, CCT5, THF1, TOA2, TOA1, SUA7, TAF90, TAF61, TAF25, TAF60, TAF17 , TAF145, TAF19, TAF40, TAF67, TFA2, TFA1, FCP1, TFG1, TFG2, TFB1, CCL1, SSL1, TFB3, TFB2, PZF1, BRF1, TFC5, TFC4, TFC3, TFC7, TFC6, TFC1, SPT15, THI80, THS1 , SPT6, SPT5, ROX3, REB1, MCM1, MED4, MOT1, MED8, EFB1, YEF3, SUI1, CDC95, TIF11, SUI3, GCD11, SU12, GCD6, GCD7, GCD2, GCD1, RPG1, GCD10, PRT1, TIF34, CDC33 , TIF5, SUP45, GCD14, TIM54, SEC17, TPT1, TRL1, CCA1, SEN54, SEN2, SEN15, SEN34, WRS1, SLN1, TYS1, SNU56, PRP42, CUS1, PRP4, PRP8, SNU114, USS1, UFD1, SMT3, RSP5 , QR11, ALG7, UGP1, VTI1, VAS1, SEC18, CTR86 和 ZPR1。

2. 病毒

本文件中提供的微生物包括病毒。这些病毒通常具有本文所述的一种或多种微生物特征。例如，本文提供的病毒具有减弱的致病性、降低的毒性、在免疫特权细胞和组织（例如肿瘤）中的优先积累、产生针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、具有免疫原性、能够复制并且能够表达外源蛋白及其组合。在一些实施方案中，病毒具有在不积极杀死肿瘤细胞的情况下发起针对肿瘤细胞的免疫反应的能力。

本文提供的病毒可以是细胞质病毒，例如痘病毒，或者可以是核病毒，例如腺病毒。本文提供的病毒可将宿主细胞质膜裂解作为其生命周期的一部分。或者，本文提供的病毒可以通过非裂解途径离开宿主细胞，例如出芽或胞吐作用，作为其生命周期的一部分。作为病毒生命周期一部分的裂解或诱导的细胞凋亡，本文提供的病毒可导致宿主生物体产生针对病毒感染的肿瘤细胞的免疫应答。本文提供的病毒还可以通过遗传工程改造以引起宿主生物体由于裂解或细胞凋亡而对病毒感染的肿瘤细胞产生免疫反应，无论裂解或细胞凋亡是否被诱导本身。病毒生命周期的一部分.在一些实施方案中，本文提供的病毒可以引发宿主生物体产生针对肿瘤细胞的免疫应答而不裂解肿瘤细胞或引起细胞死亡。

本领域技术人员可以根据多种因素选择多种病毒中的任一种，包括但不限于病毒的预期用途（例如，外源蛋白生产、抗体生产或肿瘤治疗）。 、宿主生物体和肿瘤类型。

A. 细胞质病毒

本文提供的病毒可以是细胞质病毒，其中病毒的生命周期不需要病毒核酸分子进入宿主细胞核。多种细胞质病毒是已知的，包括但不限于天花病毒、非洲猪流感家族的病毒和各种RNA病毒，例如p。 B. picorna 病毒、calici 病毒、toga 病毒、冠状病毒和横纹病毒。在一些实施方案中，病毒核酸分子在整个病毒生命周期中不进入宿主细胞核。在其他实施方案中，病毒生命周期可以在不使用宿主细胞核蛋白的情况下进行。在其他实施方案中，病毒的毒力或致病性可以通过调节参与病毒复制的一种或多种病毒蛋白的活性来调节。

一、天花病毒

在一个实施例中，本文提供的病毒选自痘病毒科。痘病毒包括正痘病毒、副痘病毒、禽痘病毒、羊痘病毒、兔痘病毒、猪痘病毒、软体动物痘病毒、亚塔痘病毒等脊痘病毒亚科，以及甲型内痘病毒、乙型内痘病毒、甲型内痘病毒等内痘病毒亚科。因此，这些痘病毒中的任何一种都可以在这里使用。本领域的普通技术人员可以基于该属或个体病毒的已知特征并根据所选择的病毒特征（例如，致病性、诱导免疫反应的能力、优选的肿瘤部位）来选择特定的属或个体Cordopoxyirinae。 、病毒的预期用途、肿瘤的种类和宿主生物体。 Cordopoxyirinae 属的实例是正痘病毒属和禽痘病毒属。

已知禽痘病毒可感染多种鸟类，并已被施用于人类。禽痘病毒的实例包括金丝雀痘、禽痘、灯芯草痘、八哥痘、pombox、鹦鹉痘、鹌鹑痘、孔雀、鸟痘、企鹅、麻雀痘、星痘和火鸡痘。

已知正痘病毒可感染多种哺乳动物，包括啮齿动物、家畜、灵长类动物和人类。一些正痘病毒具有广泛的宿主范围，而另一些则具有较窄的宿主范围。正痘病毒的实例包括水牛痘病毒、骆驼痘病毒、牛痘病毒、水痘病毒、猴痘病毒、浣熊病毒、臭鼬痘病毒、水痘病毒、uasin gishu病毒、牛痘病毒、天花病毒和伏痘病毒。在一些实施方案中，所选择的正痘病毒可以是已知感染人类的​​正痘病毒，例如牛痘病毒、猴痘病毒、牛痘病毒或天花病毒。任选地，已知感染人类的​​正痘病毒可以选自广泛宿主范围的正痘病毒，例如牛痘病毒、猴痘病毒或牛痘病毒。

A. 病毒痘苗

正痘病毒的一个例子是痘苗病毒。有多种痘苗病毒株可用，包括Western Reserve (WR)、Copenhagen、Tashkent、Tian Tan、Lister、Wyeth、IHD-J和IHD-W、Brighton、Ankara、MVA、Dairen I、L-IPV、LC16M8。 LC16MO，LIVP，WR 65-16，纽约市康诺特卫生部。痘苗病毒的例子是 Lister 或 LIVP 痘苗病毒。与本文提供的或本领域技术人员已知的任何已知的痘苗病毒或其变体相似以降低痘苗病毒的毒性。但一般情况下，突变会是多重突变体，病毒会被进一步选择以降低毒性。

线性痘苗病毒病毒 dsDNA 基因组大小约为 200 kb，总共编码大约 200 个潜在基因。病毒基因表达可分为三个阶段。在早期阶段，基因表达主要用于病毒复制和宿主免疫系统的防御。在中期，可以表达早期不能表达的基因，包括晚期反式激活因子。在后期，主动转录主要为病毒结构成分服务，构建成熟病毒。

痘苗病毒具有多种特性，可用于基因治疗和癌症疫苗接种。它具有多种宿主和细胞类型。痘苗病毒是一种细胞质病毒，因此在其生命周期中不会将其基因组插入宿主基因组。与需要宿主转录机制的许多其他病毒不同，痘苗病毒可以通过使用病毒基因组中编码的酶来支持其自身在宿主细胞细胞质中的基因表达。痘苗病毒基因组具有很高的携带外源基因的能力，能够插入多达 25 kb 的外源 DNA 片段（约为痘苗基因组大小的 12%）。几种痘苗病毒株的基因组已被完全测序，许多必需和非必需基因已被鉴定。由于不同菌株之间的高度序列同源性，来自一种牛痘菌株的基因组信息可用于设计和生成其他菌株的修饰病毒。最后，用于生产转基因牛痘菌株的技术已经很成熟（Moss, Curr. Opin. Genet. Dev. 3 (1993), 86-90 ；Broder and Earl, Mol. Biotechnol. 13 (1999), 223-245 Timiryasova 等al., Biotechniques 31 (2001), 534-540)。

过去，牛痘病毒被用来免疫天花。最近，正在开发修饰的痘苗病毒作为疫苗来对抗多种疾病。减毒的痘苗病毒可以触发细胞介导的免疫反应。初级/加强疫苗接种、非复制型痘苗病毒疫苗接种或这些策略的组合等策略已显示出可用于开发安全有效的疫苗接种方案的有希望的结果。先前研究的痘苗病毒突变体有多种缺点，包括无法将病毒载体有效地仅输送到所需组织（例如，在肿瘤中特异性积累），由于可能出现严重并发症而缺乏安全性（例如，在儿童中） 、婴儿、湿疹和脑炎疫苗，以及在成人中，如果该人免疫功能严重受损，可能会出现播散性或进行性牛痘）。

B. 改良型痘苗病毒

本文提供的痘苗病毒具有如本文更一般性描述的插入、突变或缺失。痘苗病毒被修饰或选择为具有低毒性并定位于靶组织。这种病毒的例子是 LIVP 毒株。

示例性的插入、突变或缺失是导致与野生型毒株相比减毒的痘苗病毒的插入、突变或缺失。例如，痘苗病毒的插入、突变或缺失可能会降低痘苗病毒的致病性，例如，通过降低毒性、降低传染性、降低复制能力，或减少痘苗病毒作用的非肿瘤器官或组织的数量积累。其他示例性插入、突变或缺失包括但不限于增加微生物抗原性的插入、突变或缺失、允许检测或成像的插入、突变或缺失增加微生物毒性的插入、突变或缺失（任选地由诱导型启动子控制）。例如，可以对涉及核苷酸代谢、宿主相互作用和病毒形成的基因进行修饰。本领域已知的任何多种痘苗病毒插入、突变或缺失均可用于本文，包括以下的插入、突变或缺失：胸苷激酶(TK)基因、血凝素(HA)基因、VGF(如在美国专利公开号 20030031681）；出血区域或 A 型包涵体区域（如美国专利第 6,596,279 号所教导）； Hind III F、F13L 或 Hind III M（如美国专利号 6,548,068 中所述）； A33R、A34R、A36R 或 B5R 基因（参见，例如，Katz 等人，J. Virology 77:12266-12275 (2003)）； SalF7L (参见，例如，Moore 等人，EMBO J. 1992 11:1973-1980)； NIL（参见，例如，Kotwal 等人，Virology 1989 171:579-587）； M1 lambda（参见，例如，Child 等人，Virology. 1990 174:625-629）； HR、HindIII-MK、HindIII-MKF、HindIII-CNM、RR 或 BamF（参见，例如，Lee 等人，J. Virol. 1992 66:2617-2630）；或 C21L（参见，例如，Isaacs 等人，Proc Natl Acad Sci USA. 1992 89:628-632）。

CO Gen F3

除了本领域已知的突变之外，本文提供的痘苗病毒可以具有 F3 基因的插入、突变或缺失（SEQ ID No:1；示例性 F3 基因在 GenBank 登录号 M57977 中提供，包含核苷酸序列并且根据 LIVP 菌株 F3 的预测氨基酸，也参见 Mikryukov 等人，Biotekhnologiya 4:442-449 (1988))。例如，F3 基因在位于痘苗病毒 DNA 的 LUVP 株 HindIII F 片段内第 35 位或第 1475 位的 F3 基因内的独特 NotI 限制性位点处被修饰（Mikryukov 等人，Biotekhnologiya 4 (1988) ), 442-449) 通过将外来 DNA 序列插入到 NotI 消化的病毒 DNA 中。如本文所提供的，将核酸分子，例如含有 lacZ 的分子，插入 LIVP 株 F3 基因的 NotI 位点（M57977 中的核苷酸 1473-1480 或 SEQ ID NO: 1 的核苷酸 33-40）可以导致减少的与野生型痘苗病毒相比，痘苗病毒在裸鼠非肿瘤器官（包括大脑和心脏）中的积累。因此，用于本文提供的方法的痘苗病毒可包含F3基因的插入、突变或缺失或相应基因座的突变。例如，如本文所提供的，F3-破坏的LIVP修饰的痘苗病毒可以选择性地在体内肿瘤细胞中复制。因此，具有改变的 F3 基因的修饰的痘苗病毒（例如，修饰的 LIVP 毒株）可用于本文提供的方法，作为肿瘤定向基因治疗方法和用于检测肿瘤和转移。

因此，本文提供了具有F3基因修饰的痘苗病毒。例如，本文提供的痘苗病毒可在 F3 基因中包含外源 DNA 插入片段。外来DNA插入的实例是在对应于痘苗菌株LIVP中F3基因的NotI位点的位置或在SEQ ID NO：1的位置35处的插入。本文提供的F3修饰的痘苗病毒可特异性定位于肿瘤，因此可用于递送肿瘤特异性治疗基因。使用 BLAST（基本局部比对搜索工具）对来自不同痘苗病毒株的核苷酸序列进行 GenBank 数据分析。基于该分析，发现在哥本哈根痘苗病毒株（Goebel 等人，Virology 179（1990），247-266）中，NotI 限制性位点位于编码 F14L 和 F15L 的两个开放阅读框（ORF）之间基因。 .因此，通过将外来基因插入基因组菌株 VV Copenhagen 的 NotI 位点，不会破坏任何重要基因。在 VV-LIVP 菌株中，NotI 限制性位点位于编码功能未知的 F3 基因的 ORF 中（Mikryukov 等人，Biotekhnologiya 4 (1988), 442-449）。因此，将外来基因插入到 F3 基因的 NotI 位点会破坏 F3 基因。修改 F3 基因的能力表明它可能在病毒复制中发挥非必要的作用。虽然 F3 基因不太可能是病毒复制所必需的，但动物研究的结果表明，F3 基因的改变与病毒毒力降低、无法在大脑或卵巢中复制以及优先在肿瘤组织中复制的能力相关.

F3基因在多种不同的痘苗病毒株中是保守的，包括WR（GenBank登录号AY243312.1核苷酸42238-42387）、Ankara（GenBank登录号U94848.1核苷酸37155-37304）、天坛（GenBank登录号41808- 41954 个核苷酸 AF095689），Acambis 3000（GenBank 登录号 AY603355.1 核苷酸 31365-31514）和哥本哈根（GenBank 登录号 M35027.1 核苷酸 45368-45517）。GenBank 登录号 X94355.2），兔痘（核苷酸 46969-47118 来自 GenBank GenBank 47118登录号 AY484669.1)、骆驼痘（来自 GenBank 登录号 AY009089.1 的核苷酸 43331-43480）、马蹄莲（来自 GenBank 登录号 AY009089.1 的核苷酸 51008-51157）。 AF012825.2)、猴痘（来自 GenBank 登录号 AF380138.1 的核苷酸 42515-42660）和痘病毒（来自 GenBank 登录号 X69198.1 的核苷酸 33100-33249）。因此，等同于痘病毒（例如正痘病毒）的 F3 基因修饰，还提供了包括多种痘苗病毒株在内的产品。本领域技术人员可以鉴定多种痘病毒、正痘病毒和痘苗病毒中等同的F3基因的位置。例如，痘病毒、正痘病毒和痘苗病毒中 F3 基因的等价物可包括至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 92%、至少 94%、95%、与 SEQ ID NO: 1 中 F3 基因的核苷酸序列至少 96%、至少 97%、至少 98% 或至少 99% 同一性。在另一个例子中，F3 基因在痘病毒、正痘病毒中的等同物，并且病毒痘苗可包含具有至少 80%、至少 85%、至少 90%、至少 92%、至少 94% 的基因，包含至少 95%、至少 96%、至少 97% , 与 SEQ ID NO: 2 中 F3 的氨基酸序列至少至少 98% 或至少 99% 同一性。在另一个例子中，例如，LIVP 中的 F3 基因的等价物可以通过其结构位置来确定在病毒属中：F3 基因位于 F14L 和 F15L 开放阅读框之间的痘苗病毒的 HindIII F 片段中，如 Goebel 等人，Virology (1990) 179:247-266 所定义，与F14L 和 F15L ORF；本领域的技术人员可以容易地鉴定存在于多种相关病毒(例如多种痘病毒)中结构等同区域中的基因。

比较蛋白质序列分析揭示了有关蛋白质功能的一些信息。与 F3 基因（LIVP 菌株）编码的蛋白质最匹配的是线虫脯氨酰 4-羟化酶-α (alpha-4-PH) 亚基的前体。秀丽隐杆线虫(Veijola 等人 (1994) J. Biol. Chem. 269:26746-26753)。该α亚基与人蛋白质二硫键异构酶的β亚基形成活性α-β二聚体。 Prolyl-4-hydroxylase (EC 1.14.11.2) 催化胶原蛋白中 4-羟脯氨酸的形成。脊椎动物酶是一种 alpha-2-beta-2 四聚体，其 beta 亚基与蛋白质二硫化物异构酶 (PDI) 相同。这种蛋白质对痘苗病毒复制的重要性尚不清楚，但这种蛋白质的缺乏可能导致痘苗病毒重新定向到肿瘤组织中。

D. 各种修改

本文提供的痘苗病毒还可含有两个或更多个插入、突变或缺失。因此，包括含有两个或更多个本文提供的基因座或本领域已知的其他基因座的插入、突变或缺失的痘苗病毒。在一个实施方案中，痘苗病毒在 F3 基因中包含一个插入、突变或缺失，以及一个或多个额外的插入、突变或缺失。在修饰的痘苗病毒的一个实施方案中，至少F3基因已通过插入外来核苷酸序列进行修饰。修饰，例如F3基因的修饰，通常导致基因或基因产物至少部分失活。在一个例子中，F3 基因和 TK 基因通过插入外来核苷酸序列进行了修饰。在另一个例子中，F3基因和HA基因通过插入外来核苷酸序列进行修饰。在另一个例子中，F3 基因和 TK 和 HA 基因通过插入外源核苷酸序列进行修饰。在另一个例子中，HA基因和TK基因通过插入外源核苷酸序列被修饰。因此，本组合物和方法包括修饰的痘苗病毒，其中两个或多个(a)F3基因、(b)TK基因和(c)HA基因已经被修饰。在一个实施方案中，至少两个 F3 基因，即 TK 基因和 HA 基因，已经被灭活，例如，通过在两个 F3 基因的编码区或调节序列中插入、删除和/或取代核苷酸。这些基因中的一个或多个已因插入、删除或突变而失活。

是的。李斯特的压力

或者，本文提供的病毒和方法可以基于痘苗病毒李斯特株的修饰。李斯特牛痘病毒（也称为 Elstree）可从多种来源获得。例如，Elstree 的牛痘病毒可从 ATCC 获得，登录号为 VR-1549。 Lister 痘苗毒株在具有高基因表达的肿瘤细胞中具有高转导效率。

在一个实施例中，Lister毒株可以是减毒的Lister毒株，例如通过将Lister毒株进一步减毒产生的LIVP毒株（来自俄罗斯莫斯科病毒制备研究所的Lister病毒）。 LIVP毒株已在全世界用于疫苗接种，特别是在印度和俄罗斯，并且分布广泛。

LIVP 菌株在保持高转导效率的同时降低了致病性。例如，如本文所提供的，F3-破坏的LIVP修饰的痘苗病毒可以在体内选择性地在肿瘤细胞中复制。在一个实施方案中，本文提供了修饰的 LIVP 病毒，包括具有修饰的 TK 基因的病毒、具有修饰的 HA 基因的病毒、具有修饰的 F3 基因的病毒，以及具有修饰的 HA 基因、修饰的 TK 基因中的两种或更多种的病毒。 F3 基因修饰。

二.其他细胞质病毒

此处还提供除痘病毒以外的细胞质病毒。细胞质病毒可以在不将病毒核酸分子引入宿主细胞核的情况下进行复制。多种此类细胞质病毒是本领域已知的并且包括非洲猪流感家族的病毒和几种RNA病毒例如。 B. 沙粒病毒、小核糖核酸病毒、杯状病毒、披膜病毒、冠状病毒、副粘病毒、黄病毒、呼肠孤病毒和弹状病毒。披膜病毒的例子包括辛德比斯病毒。沙粒病毒的例子包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒。示例性的狂犬病病毒包括水疱性口炎病毒。副粘病毒的例子包括新城疫病毒和麻疹病毒。微小核糖核酸病毒的例子包括脊髓灰质炎病毒、牛肠道病毒和鼻病毒。黄病毒的例子包括黄热病病毒；减毒的黄热病病毒是本领域已知的，例如，在 Barrett 等人，Biologicals 25:17-25 (1997) 和 McAllister 等人，J. Virol. 74:9197–9205 (2000)。

本文还提供了对上述病毒的修饰以改进相对于野生型病毒的一种或多种特性。这些特性可能包括但不限于致病性减弱、毒性降低、在肿瘤中优先积累、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力增强、免疫原性增强、复制能力增强或减弱以及表达外源蛋白的能力. , 以及它们的组合。在一些实施方案中，经修饰的病毒能够在不积极杀死肿瘤细胞的情况下发起针对肿瘤细胞的免疫反应。在其他实施例中，病毒可经工程改造以表达一种或多种可检测基因，包括可成像的基因。在其他实施方案中，可以修饰病毒以表达一种或多种基因以收获基因产物和/或收获针对基因产物的抗体。

B. 腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒

此处还提供了在其生命周期中涉及核酸分子进入宿主细胞核的病毒。多种此类病毒是本领域已知的并且包括疱疹病毒、乳多空病毒、逆转录病毒、腺病毒、细小病毒和正粘病毒。疱疹病毒的例子包括 1 型单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和 Epstein-Barr 病毒。乳多空病毒的例子包括人乳头瘤病毒和 SV40 病毒。逆转录病毒的例子包括慢病毒。正粘病毒的例子包括流感病毒。示例性细小病毒包括腺相关病毒。

本文还提供了对上述病毒的修饰以改进相对于野生型病毒的一种或多种特性。这些特性可能包括但不限于致病性减弱、毒性降低、在肿瘤中优先积累、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力增强、免疫原性增强、复制能力增强或减弱以及表达外源蛋白的能力. , 以及它们的组合。在一些实施方案中，经修饰的病毒能够在不积极杀死肿瘤细胞的情况下发起针对肿瘤细胞的免疫反应。在其他实施例中，病毒可经工程改造以表达一种或多种可检测基因，包括可成像的基因。在其他实施方案中，可以修饰病毒以表达一种或多种基因以收获基因产物和/或收获针对基因产物的抗体。

3.细菌

细菌也可用于本文提供的方法中。可以使用任何具有所需特性的细菌。在一个实施例中，可以使用好氧细菌。在另一个实施例中，可以使用厌氧菌。或者，可以使用细胞外细菌。或者，可以使用细胞内细菌。

在一些实施方式中，本文提供的细菌可以是胞外细菌。多种细胞外细菌是本领域已知的并且包括弧菌、乳酸杆菌、链球菌、大肠杆菌.示例性细菌包括霍乱弧菌、化脓性链球菌, z大肠杆菌.在其他实施方式中，本文提供的细菌可以是胞内细菌。多种细胞内细菌是本领域已知的并且包括李斯特菌、沙门氏菌、梭菌和双歧杆菌。细胞内细菌的例子包括单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、溶组织梭菌、丁酸梭菌、长双歧杆菌, z青春双歧杆菌.其他细菌包括植物细菌，例如密歇根棒杆菌亚种michiganensis, 根癌农杆菌, Erwinia herbicola, Azorhizobium caulinodans, Xanthomonas campestrisp.v.吹, z油菜黄单胞菌p.v.油菜。

本文提供的细菌的另一个例子是磁性细菌。这些细菌允许通过含铁造影剂的积累来检测肿瘤。可以从新鲜和海洋沉积物中分离出磁性细菌。磁性细菌可以产生磁性颗粒 (Fe3O4) (Blakemore, Annu. Rev. Microbiol. 36 (1982), 217-238)。磁性细菌具有高效的铁摄取系统，使它们能够利用不溶性和可溶性形式的铁。 Magnetospirillum Magnetic AMB-1 是此类磁性细菌的一个例子，已被分离和培养以产生磁性颗粒（Yang 等人，Enzyme Microb.Technol. 29 (2001), 13-19）。如本文所提供的，这些磁性细菌（天然存在的或基因修饰的）在静脉内注射时可以选择性地积聚在肿瘤中。因此，这些细菌可用于富集肿瘤中的铁基造影剂，从而允许对肿瘤进行 MRI 检测。同样，其他自然产生的积累金属的细菌菌株可用于肿瘤检测、造影剂摄取金属和肿瘤成像。

本文还提供了细菌修饰以改善野生型细菌的一种或多种特性。这些特性可能包括但不限于致病性减弱、毒性降低、在肿瘤中优先积累、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力增强、免疫原性增强、复制能力增强或减弱以及表达外源蛋白的能力. , 以及它们的组合。在一些实施方案中，经修饰的细菌能够在不积极杀死肿瘤细胞的情况下发起针对肿瘤细胞的免疫反应。在其他实施方案中，细菌可以被工程化以表达一种或多种可检测基因，包括可以用于成像的基因。在其他实施方案中，细菌可以被工程化以表达一种或多种基因，以收获基因产物，和/或收获针对基因产物的抗体。

好氧菌

先前的研究假设厌氧菌更适合递送至肿瘤（Lemmon 等，1997 Gene Therapy 4：791-796）。如本文所提供的，已发现好氧细菌能够在肿瘤中存活和生长。因此，本文提供的方法中使用的细菌可包括能够在富氧环境中存活和生长的细菌。在一些实施例中，细菌需要处于富氧环境中才能生存和生长。多种好氧细菌是本领域已知的，包括乳酸杆菌、沙门氏菌, 链球菌, 葡萄球菌,弧菌、李斯特菌, z大肠杆菌.示例性细菌包括Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus lactis, Lactobacillus fermentum, Streptococcus thermophilus B. 枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、耻垢分枝杆菌、母牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、哈瓦那分枝杆菌、粪肠球菌、荧光假单胞菌, z恶臭假单胞菌。

B、厌氧菌

在本文提供的方法中使用的细菌可以包括不需要氧气来存活和生长的细菌。在一些实施例中，细菌必须处于无氧环境中才能存活和生长。多种好氧细菌是本领域已知的，包括梭状芽胞杆菌, 双歧杆菌。示例性细菌包括B. 动物双歧杆菌、以色列放线菌、迟缓真杆菌、消化链球菌厌氧菌，来自发酵氨基酸球菌的普氏消化球菌。

4. 真核细胞

还包括在本文提供的微生物以及制造和使用此类微生物的方法中的是真核细胞，包括多细胞真核生物的细胞，包括哺乳动物例如灵长类动物，示例性细胞是人类细胞。细胞通常是单细胞。例如，真核细胞可以是肿瘤细胞，包括哺乳动物肿瘤细胞，例如灵长类肿瘤细胞，示例性的灵长类肿瘤细胞是人类肿瘤细胞，例如人类乳腺癌细胞。在另一个例子中，真核细胞可以包括纤维肉瘤细胞，例如。 B. 人类纤维肉瘤细胞。人纤维肉瘤细胞的实例包括 HT1080（ATCC 登录号 CCL-121、CRL-12011 或 CRL-12012）。在另一个例子中，真核细胞可以包括干细胞，包括哺乳动物干细胞，例如灵长类动物干细胞，其中示例性灵长类动物干细胞是人类干细胞。

本文还提供了对真核细胞的修饰以改善野生型细胞的一种或多种特性。这些特性可能包括但不限于致病性减弱、毒性降低、在肿瘤中优先积累、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力增强、免疫原性增强、复制能力增强或减弱以及表达外源蛋白的能力. , 以及它们的组合。在一些实施方案中，经修饰的真核细胞能够在不积极杀死肿瘤细胞的情况下产生针对肿瘤细胞的免疫反应。在其他实施方案中，真核细胞可以被工程化以表达一种或多种可检测基因，包括可以用于成像的基因。在其他实施方案中，可修饰真核细胞以表达一种或多种基因以收集基因产物和/或收集针对基因产物的抗体。

C. 改良微生物的生产方法

本文提供的微生物可以通过本领域公知的标准方法产生，用于修饰微生物，例如病毒、细菌和真核细胞。简而言之，这些方法包括将一种或多种遗传修饰引入微生物，然后针对反映修饰的特性或其他所需特性筛选微生物。

1. 遗传变化

分子生物学中的标准技术可用于产生本文提供的修饰的微生物。此类技术包括各种核酸操作技术、核酸印迹方案、核酸扩增方案和本领域已知的其他分子生物学技术。例如，可以通过使用寡核苷酸介导的定点诱变将点突变引入感兴趣的基因中。或者，同源重组可用于将突变或外来序列引入感兴趣的靶序列。核酸转移方案包括氯化钙转化/转染、电穿孔、脂质体介导的核酸转移、N-[1-(2,3-二酰氧基)丙基]-N,N,N-介导的转化、甲基硫酸三甲基铵等。 .在替代诱变方案中，也可以选择给定基因中的点突变以应用正选择压力。参见，例如，Current Techniques in Molecular Biology（eds. Ausubel 等人）。核酸扩增方案包括但不限于聚合酶链式反应 (PCR)。诸如质粒、载体、启动子和其他调控序列的核酸工具的使用在本领域中对于多种病毒和细胞生物体是众所周知的。此外，可以从许多不同的来源获得各种各样的核酸工具，包括 ATCC 和各种商业来源。本领域技术人员将能够基于他的本领域知识和设计选择容易地选择合适的工具和方法来对任何特定病毒或细胞生物体进行遗传修饰。

使用本领域已知的标准分子生物学技术可以容易地进行多种修饰。修饰通常是微生物基因组的一个或多个截断、删除、突变或插入。在一个实施例中，修饰可以特定于特定序列。修饰可以针对微生物基因组的多种区域中的任何区域，包括但不限于调节序列、基因编码序列或没有已知功能的序列。对于许多微生物，包括本文具体列出的微生物，可用于修饰的微生物基因组的多种区域中的任何区域是本领域众所周知的。作为一个非限制性实例，本文别处提供的多种痘苗基因的基因座说明了本文提供的微生物中可被修饰的不同区域的数量。或者，修饰可以全部或部分随机化，之后可以根据修饰微生物的所需特性来确定任何特定修饰微生物的选择。

在一些实施例中，可以修饰微生物以表达外源基因。外源基因产物的例子包括蛋白质和 RNA 分子。经修饰的微生物可表达可检测的基因产物、治疗性基因产物、用于生产或收获的基因产物或用于产生抗体的抗原性基因产物。此类基因产物的特性在本文件的其他地方进行了描述。在修饰生物体以表达外来基因的一些实施方案中，修饰还可以包含一个或多个调节序列以调节外来基因的表达。如本领域已知的，调节序列可以允许外来基因的组成型表达或外来基因的诱导性表达。此外，调控序列可以控制外源基因的表达水平。在一些实例中，可诱导表达可以在存在于肿瘤细胞中或存在于被微生物感染的肿瘤细胞中的细胞因子或其他因子的控制下。在其他实例中，可诱导表达可以在可施用物质的控制下，包括IPTG、RU486或其他已知的诱导化合物。根据已知因素和设计偏好，本领域技术人员可以获得多种调节序列中的任一种。在某些模式中，例如基因产物的生产和收获，调节序列可以导致组成型高水平的基因表达。在一些实施方案中，例如产生抗（基因产物）抗体，调节序列可导致较低的基因表达组成型水平。在肿瘤治疗方式中，治疗性蛋白质可以处于内部诱导型启动子或外部诱导型启动子的控制之下。

在其他实施例中，器官或组织特异性表达可由调控序列控制。为了仅在靶器官例如待治疗的肿瘤中实现表达，可以将外源核苷酸序列连接至组织特异性启动子并用于基因治疗。此类启动子是本领域技术人员众所周知的（参见，例如，Zimmermann 等人，(1994) Neuron 12, 11-24 ；Vidal 等人；(1990) EMBO J. 9, 833-840 ；Mayford et al., (1995), Cell 81, 891-904, Pinkert et al., (1987) Genes & Dev. 1, 268-76)。

在一些实施方案中，微生物可以被工程化以表达两种或更多种蛋白质，其中两种或更多种蛋白质的任何组合可以是一种或多种可检测基因产物、治疗基因产物、制造或收获基因产物、或用于抗体收集的抗原基因产物. .在一个实施例中，可以修饰微生物以表达可检测的蛋白质和治疗性蛋白质。在另一个实施方案中，可以修饰微生物以表达两种或更多种检测基因产物或两种或更多种治疗基因产物。例如，一种或多种参与荧光素酶底物生物合成的蛋白质可以与荧光素酶共表达。当引入两个或多个外源基因时，这些基因可以在相同或不同的调控序列下被调控，并且可以通过一个或多个遗传操作步骤将基因插入微生物基因组的相同或不同区域。在一些实施方案中，一个基因，例如编码可检测基因产物的基因，可以处于组成型启动子的控制之下，而第二个基因，例如编码治疗基因产物的基因，可以处于组成型启动子的控制之下启动子。诱导型启动子。启动子将两个或多个基因引入微生物的方法是本领域已知的并且可以使用多种外源基因、调节序列和/或其他核酸序列容易地对多种微生物进行。

在微生物改造程序的一个示例性实施方案中，LIVP 痘苗病毒株被改造为在病毒基因组的三个不同位点包含外源 DNA 插入片段。使用本领域已知的一般方法、已知分子生物学工具和本领域已知或本文描述的序列可用于产生修饰的痘苗病毒株，包括在F3基因、TK基因和/或包括 HA 基因。 .参见，例如，Mikryukov 等人，Biotekhnologya 4 (1998)，442-449； Goebel 等人，病毒学 179 (1990)，247-266； Antoine 等人 (1998) Virology 244:365-396； Mayr 等人，Centbl。细菌。高。部门 1 起源。 B 167（1978），375-390；日本安藤和松本。 J.微生物。 14:181-186（1979）； Sugimoto 等人，微生物。免疫学。 29:421-428（1985）； Takahashi-Nishimaki 等人，J. Gen. Virol。 68:2705-2710 (1987)。这些方法包括，例如，体外重组技术、合成方法和体内重组方法，例如 Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor 中描述的那些NY ( 1989) 以及本文档中描述的示例。本领域技术人员可以从任何牛痘毒株中分离编码F3基因产物(或相关基因产物)的基因，例如，使用SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 10. 12的F3基因核苷酸序列， 14、16、18、20、22、24、26、28 或 32 或其片段作为探针以选择文库。

用于产生重组微生物的方法是本领域已知的。用于产生重组痘苗病毒的方法在本文中以举例的方式提供。具有插入F3基因(LIVP NotI位点)的重组痘苗病毒可以通过以下步骤产生：(a)生成(i)包含插入位点的修饰的痘苗递送质粒，插入位点X， (ii)) 在限制性位点 X 消化的去磷酸化 VV wt (VGL) DNA； (b) 用来自步骤 a 的 (i) 和 (ii) 的构建体的混合物转染 PUV 灭活的辅助 VV (VGL) 感染的宿主细胞； (c) 从转染子中分离重组痘苗病毒。本领域技术人员知道如何进行这样的程序，例如，按照实施例 1 中给出的说明和菲戈。 1个;也参见 Timiryasova 等人，Biotechniques 31 (2001)，534-540。在一个实施例中，X限制位点是单个限制位点。多种合适的宿主细胞也是本领域技术人员已知的，包括许多易受痘苗病毒感染的哺乳动物、鸟类和昆虫细胞和组织，包括例如鸡胚肾细胞、兔、仓鼠和猴子。 B. HeLa 细胞、RK13、CV-1、Vero、BSC40 和 BSC-1 猴肾细胞。

2. 针对以上特征进行筛选

可以筛选修饰的微生物的任何所需特性，包括本文所述的特性，例如致病性降低、毒性降低、肿瘤优先积聚、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力增加、免疫原性增加、复制能力增加或减少，并且是能够表达外源蛋白及其组合。例如，可以筛选转基因微生物在不积极杀死肿瘤细胞的情况下引发针对肿瘤细胞的免疫反应的能力。在另一个实例中，可以针对一种或多种可检测基因的表达筛选微生物，包括可用于成像的基因，或针对一种或多种基因的表达以产生或收获基因产物和/或收集抗体。 .

如本文提供的示例中所证明的，可以实施检测此类性状的多种已知方法中的任何一种。检测所需性状的示例性方法包括但不限于监测细胞培养物或其他体外培养基中的生长、复制和/或基因表达（包括外源基因的表达）。细胞培养物可以来自任何生物体和组织来源并且可以包括肿瘤组织。所需性状检测方法的其他实例包括但不限于将微生物施用于动物，包括非人类动物如小鼠、猴子或猿，并且任选地还包括人类，并监测微生物、肿瘤、和/或动物；可以使用微生物和/或肿瘤的体内成像（例如，微生物基因表达的低光成像或肿瘤的超声成像）、肿瘤的外部监测（例如，外部测量肿瘤的大小、肿瘤的大小）、动物的监测（例如，监测动物的体重、全血细胞计数、抗体滴度、脾脏大小或肝脏大小）。检测所需性状的其他示例性方法包括但不限于获取非人类动物以确定微生物的作用和定位以及微生物的表达，包括诸如获取多种器官的方法，包括肿瘤，用于确定器官或肿瘤中微生物的存在和/或微生物的基因表达，切除与免疫反应或微生物清除相关的器官，如脾脏或肝脏，切除肿瘤以确定肿瘤大小和生存能力肿瘤细胞，去除抗体或产生抗体的细胞。这样的检测和控制方法可以以本领域已知的多种组合使用。在一个实施例中，可以通过将微生物施用于动物，例如人或非人动物，然后进行体内成像监测来检查微生物。或者，可以通过将微生物给予动物，例如非人类动物，通过体内成像监测，然后收获动物来检查微生物。因此，本文提供了通过将微生物施用于动物如携带肿瘤的动物并监测动物、肿瘤（如果存在）和/或动物体内的微生物来检查微生物的所需特性的方法随着时间的推移。或更多属性。本文还提供了检查微生物的所需特性、将微生物施用于非人类动物如患有肿瘤的非人类动物、收获动物并分析动物器官、抗体效价和/或肿瘤的方法. （如果存在）一个或多个功能。

本文提供了用于检查微生物的致病性减弱或毒性降低的方法，其中致病性或毒性可以通过多种技术来确定，包括但不限于评估受试者的健康状况、测量受试者的体重、分析受试者的血液或尿液，并监测受试者体内微生物的组织分布；此类技术可以在活体受试者身上进行，也可以在死后进行。该方法还可以涉及微生物裂解细胞或引起细胞死亡的能力，这可以在体内或体外测定。

如果受试者低于阈值体重，则微生物可被认为对该受试者具有致病性。示例性阈值可以是体重从基线下降约5%或更多、下降约10%或更多、或下降约15%或更多。体重参考可以选自本领域中使用的多种参考；例如，体重参考可以是受试者在施用微生物之前的体重，体重参考可以是与测试受试者具有相同条件（例如，正常或注射了肿瘤）的对照受试者，具有将对照的体重变化与受试者在施用微生物后随时间的体重变化进行比较。

对受试者血液或尿液的分析可以表明免疫反应的强度、受试者体内的毒素水平或受试者细胞、组织或器官（例如肾脏、胰腺、肝脏和脾脏）的其他压力水平. .已经上升到超过既定阈值的水平可能表明微生物对受试者的致病性。指示微生物致病性的血液或尿液成分的阈值是本领域众所周知的，并且可以根据微生物的所需致病性或毒性耐受性在本文中选择任何此类阈值。

微生物在患者体内的组织分布可以指示微生物的致病性或毒性。在一个实施例中，相对于其他组织或器官，既非致病性也非毒性的微生物的组织分布可能主要在肿瘤内。例如，主要存在于肿瘤中的微生物可能至少多 2 倍、至少多 5 倍、至少多 10 倍、至少多 100 倍、至少多 1000 倍、至少多积累约 10,000 倍，比微生物在任何其他特定器官或组织中的积累多至少约 100,000 倍，或至少约 1,000,000 倍。

本文提供了检查微生物的组织分布或积累的方法，其中组织分布可以通过多种技术确定，包括但不限于从非人类受试者中收获、微生物中可检测基因产物的体内成像主题。可以通过处死非人类受试者并确定微生物在肿瘤中的积累以及任选地在一种或多种另外的组织或器官中的积累来进行收获。积累可以通过多种方法确定，包括但不限于检测基因产物，例如可检测的基因产物（例如，gfp 或 β-半乳糖苷酶）、组织、器官或肿瘤的组织学或显微镜评估，或测量组织、器官或肿瘤样本中存在的斑块或集落形成单位的数量。在一个实施方案中，相对于其他组织或器官，所需量的微生物组织分布可能主要在肿瘤中。例如，主要存在于肿瘤中的微生物可能至少多 2 倍、至少多 5 倍、至少多 10 倍、至少多 100 倍、至少多 1000 倍、至少多积累约 10,000 倍，比微生物在任何其他特定器官或组织中的积累多至少约 100,000 倍，或至少约 1,000,000 倍。

本文还提供了筛选能够引发免疫反应的微生物的方法，其中免疫反应可以针对肿瘤细胞或针对微生物。用于测量引发免疫应答的能力的多种方法是本领域已知的并且包括测量受试者免疫活性的总体增加、测量受试者中抗微生物或抗肿瘤抗体的增加、测试受试者接受治疗的能力与微生物（通常是非人类）一起使用，以防止进一步感染/肿瘤形成或快速杀死微生物或肿瘤细胞。该方法还可以涉及微生物裂解细胞或引起细胞死亡的能力，这可以在体内或体外测定。

本文还提供了通过监测微生物的复制率来确定增加或减少的复制能力的方法。这种测量可以在体内或体外进行。例如，细胞培养物中的复制率可用于确定微生物的复制能力。在另一个例子中，受试者的组织、器官或肿瘤中的复制速率可用于测量复制能力。在一些实施方案中，非肿瘤组织和器官中减少的复制竞争可能是在屏幕上选择的特征。在其他实施例中，肿瘤中增加的复制能力可能是在屏幕上选择的特性。

本文还提供了用于确定微生物表达基因如外来基因的能力的方法。所述方法可以在体内或体外进行。例如，可以在选择性平板上筛选微生物表达允许微生物存活或允许微生物产生可检测信号如基因的基因的能力。 B. X—Gal 蓝。此类方法也可以在体内进行，其中表达可以例如通过解剖来自非人类受试者的组织、器官或肿瘤，或通过受试者的体内成像来确定。

本文还提供了用于确定微生物表达受试者可针对其产生抗体的基因的能力的方法，包括受试者可针对其产生抗体的外源基因。此类方法可以使用多种非人类对象在体内进行。例如，基因表达可通过从已施用微生物的非人类受试者抽取血液并测试血液（或血清）中是否存在针对由微生物表达的基因的抗体，或通过任何其他方法来确定。常用接受。收集多克隆抗体，例如

本文还提供了用于检测具有本文提供的两种或更多种特性的微生物的方法，包括检测致病性减弱、毒性降低、肿瘤优先积聚、激活针对肿瘤细胞的免疫应答的能力增强、免疫原性增强、增加复制，或降低表达外来蛋白质的能力，并诱导产生针对微生物表达的基因产物的抗体。单一监测技术，例如 B. 体内成像可用于验证两个或多个特征，或者可使用多种不同的监测技术，由主题专家根据所选特征和监测确定使用的技术。 .

D. 治疗方法

本文提供治疗方法，包括治疗或预防免疫豁免细胞或组织，包括癌细胞、肿瘤和转移的方法。本文提供的方法包括向患有肿瘤和/或转移瘤的患者施用微生物。本文提供的方法不需要微生物来杀死肿瘤细胞或减小肿瘤的大小。相反，本文提供的方法涉及向受试者施用能够在受试者中诱导或加强抗肿瘤免疫反应的微生物。在一些实施例中，可将本文提供的微生物施用于受试者而不会在受试者中引起微生物诱发的疾病。在一些实施方案中，微生物可以在肿瘤或转移瘤中积累。在一些实施方案中，微生物可以在受试者中引发抗肿瘤免疫反应，其中微生物介导的抗肿瘤免疫反应通常可以进行几天，例如一周或更长时间、10天或更长时间、两周或更长时间。多或一个月或更长时间因微生物引起的肿瘤细胞很少或没有死亡。在一些示例性方法中，微生物可存在于肿瘤中并引发抗肿瘤免疫反应，而微生物本身不会引起足够的肿瘤细胞死亡以防止肿瘤生长。

在一些实施方案中，本文提供了在受试者中诱导或增加针对所选抗原或所选类型抗原的抗体产生的方法，该方法包括向受试者施用存在于肿瘤和/或转移瘤中的微生物可以和/或可导致从肿瘤中释放选定的抗原或抗原类型，导致产生针对选定抗原或抗原类型的抗体。施用的微生物可能具有一种或多种特性，包括致病性减弱、毒性低、在肿瘤中优先积聚、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力、免疫原性、复制能力、表达外来基因的能力以及诱导生产的能力针对表达的微生物基因产物的抗体。

在本文提供的方法中可以靶向多种抗原中的任何一种，包括选定的抗原，例如微生物表达的外源基因产物，或选定类型的抗原，例如从肿瘤释放的一种或多种肿瘤抗原。作为肿瘤微生物感染的结果（例如，通过裂解、细胞凋亡、分泌或影响肿瘤抗原释放的其他机制）。在至少一些实施方案中，可能需要持续释放所选抗原或抗原类型数天，例如B.至少一周，至少十天，至少两周，或者至少一个月。

本文还提供了在受试者中持续释放抗原的方法，该方法包括向受试者施用能够在肿瘤中积聚和/或转移并引起抗原持续释放的微生物，导致产生针对抗原的抗体。抗原的延长释放可以持续几天，例如至少一周、至少十天、至少两周或至少一个月。施用的微生物可能具有一种或多种特性，包括致病性减弱、毒性低、在肿瘤中优先积聚、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力、免疫原性、复制能力、表达外来基因的能力以及诱导生产的能力针对表达的微生物基因产物的抗体。抗原的持续释放可能导致感染微生物的宿主产生免疫反应，其中宿主可能产生针对抗原的抗体和/或宿主可能对表达抗原的细胞产生免疫反应，包括针对肿瘤细胞。因此，抗原的持续释放可以导致针对肿瘤细胞的免疫。在一些实施方案中，由微生物介导的持续释放针对肿瘤细胞的抗原诱导的免疫反应可导致所有肿瘤细胞的完全消除或死亡。

本文还提供了抑制受试者肿瘤生长的方法，该方法包括向受试者施用能够在肿瘤中积聚和/或转移并引发或加强抗肿瘤免疫反应的微生物。由于肿瘤或转移瘤中微生物的积累而诱导的抗肿瘤免疫反应可抑制肿瘤生长。施用的微生物可能具有一种或多种特性，包括致病性减弱、毒性低、在肿瘤中优先积聚、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力、免疫原性、复制能力、表达外来基因的能力以及诱导生产的能力针对表达的微生物基因产物的抗体。

本文还提供了抑制受试者转移瘤生长或形成的方法，该方法包括向受试者施用微生物，该微生物在肿瘤和/或转移瘤中积累并引发或可增强抗肿瘤免疫应答。由于肿瘤或转移微生物的积累而诱导的抗肿瘤免疫反应可能导致生长或转移的抑制。施用的微生物可能具有一种或多种特性，包括致病性减弱、毒性低、在肿瘤中优先积聚、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力、免疫原性、复制能力、表达外来基因的能力以及诱导生产的能力针对表达的微生物基因产物的抗体。

本文还提供了减小受试者中肿瘤和/或转移灶大小的方法，该方法包括向受试者施用微生物，该微生物在肿瘤和/或转移灶中积聚并引发具有抗肿瘤活性的免疫反应。或者您可以加强它。由于微生物在肿瘤或转移瘤中的积累而诱导的抗肿瘤免疫反应可能导致肿瘤和/或转移瘤的大小减小。施用的微生物可能具有一种或多种特性，包括致病性减弱、毒性低、在肿瘤中优先积聚、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力、免疫原性、复制能力、表达外来基因的能力以及诱导生产的能力针对表达的微生物基因产物的抗体。

本文还提供了从受试者消除肿瘤和/或转移瘤的方法，该方法包括向受试者施用微生物，该微生物在肿瘤和/或转移瘤中积累并引发或可以增强抗肿瘤免疫应答。由于微生物在肿瘤或转移瘤中的积累而诱导的抗肿瘤免疫反应可导致从受试者消除肿瘤和/或转移瘤。施用的微生物可能具有一种或多种特性，包括致病性减弱、毒性低、在肿瘤中优先积聚、激活针对肿瘤细胞的免疫反应的能力、免疫原性、复制能力、表达外来基因的能力以及诱导生产的能力针对表达的微生物基因产物的抗体。

本文提供的缩小、抑制肿瘤生长、抑制肿瘤生长和/或转移、缩小肿瘤或转移、消除肿瘤或转移的方法或其他肿瘤治疗方法包括在宿主中引发或增强抗肿瘤免疫反应。宿主的免疫反应本质上是抗肿瘤的，可以针对微生物已经聚集的肿瘤和/或转移灶，也可以针对微生物没有聚集的肿瘤和/或转移灶，包括肿瘤和/或转移比向受试者施用微生物后发生转移。因此，其生长或形成被抑制或尺寸减小或消除的肿瘤和/或转移瘤可能是其中微生物已经积累的肿瘤和/或转移瘤，或者它也可能是其中微生物已经聚集的肿瘤和/或转移瘤。没有积累。因此，本文提供了减少、抑制肿瘤生长、抑制生长和/或转移、减小肿瘤或转移的大小、去除肿瘤或转移或其他肿瘤治疗方法的方法，该方法包括向受试者施用微生物，其中微生物在至少一种肿瘤或转移灶中积聚，并在受试者中引发或增强抗肿瘤免疫反应，并且该免疫反应也是针对微生物细胞未在其中积累的肿瘤和/或转移灶。在另一个实施方案中，提供了用于抑制或预防肿瘤疾病复发或用于抑制或预防新肿瘤生长的方法，该方法包括向受试者施用能够在肿瘤中积聚和/或转移的微生物，并且它可以引发或增强抗肿瘤免疫反应，并且抗肿瘤免疫反应可以抑制或预防肿瘤疾病的复发或抑制或预防新肿瘤的生长。

本文提供的用于肿瘤或肿瘤疾病的治疗方法，例如减少、抑制肿瘤生长、抑制生长和/或转移、减小肿瘤或转移的大小、去除肿瘤或转移的方法或其他方法还包括肿瘤治疗。可以向受试者施用能够引起肿瘤细胞裂解或死亡的微生物。所述微生物可以是能够在受试者中引发或加强抗肿瘤免疫反应的相同微生物。由于内源基因的表达或外源基因的结果，微生物，例如本文提供的微生物，可以引起细胞裂解或肿瘤细胞死亡。如本领域已知的，内源或外源基因可由于直接或间接作用导致肿瘤细胞溶解或抑制细胞生长，包括溶解通道的形成或细胞凋亡途径的激活。基因产物，如外源基因产物，可以激活活性细胞毒性形式的前药，导致表达此类基因的细胞死亡。

用于产生抗原或用于治疗肿瘤和/或转移瘤的所述方法可以包括施用本文所述的修饰微生物或具有与本文提供的具有F3基因修饰的痘苗病毒功能等同的修饰的微生物。和/或 HA 基因的 TK 基因用于治疗，例如用于基因治疗、用于癌症基因治疗或用于疫苗治疗。此类微生物可用于刺激体液和/或细胞免疫反应，以在可受益于此类反应的个体中引发有效的细胞毒性 T 淋巴细胞反应。例如，微生物可以通过使用表达免疫反应性抗原的微生物将细胞从肿瘤或病变中排斥而提供针对被微生物感染的肿瘤或其他传染性疾病的预防和治疗效果(Earl et al. (1986) Science 234, 728-831； Lathe 等人 (1987) Nature (London) 326, 878-880)，细胞肿瘤相关抗原（Bemards 等人, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6854-6858）。埃斯汀等人。 (1988) 过程。美国国家科学院 85, 1052-1056。坎特等人。 (1992) J. Natl。癌症研究所 84, 1084-1091。罗斯等人。 (1992)。 1996), 过程。美国国家科学院 93, 4781-4786) 和/或细胞因子（例如 IL-2、IL-12）、共刺激分子（B7-1、B7-2）（Rao et al. (1996) J. Immunol. 156, 3357-3365 Chamberlain 等人 (1996) Cancer Res 56, 2832-2836 Oertli 等人 (1996) J Gen Virol 77, 3121-3125 Qin 和 Chatterjee (1996) Human Gene Ther 7, 1853-1860, McAneny 等人(1996) Ann Surg Oncol 3, 495-500) 或其他治疗性蛋白质。

如本文所提供的，可以用微生物如痘苗病毒治疗实体瘤，导致肿瘤特异性微生物的大量复制，这可以导致肿瘤蛋白抗原和蛋白质病毒在肿瘤中的产生。如本文所提供的，对小鼠施用痘苗病毒导致受感染的肿瘤细胞裂解并随后释放肿瘤细胞特异性抗原。这些抗原不断渗漏到体内导致小鼠体内针对肿瘤蛋白、病毒蛋白和修饰的病毒编码蛋白产生非常高的抗体滴度（约 7 至 14 天）。新合成的抗肿瘤抗体和增加的巨噬细胞和嗜中性粒细胞数量通过脉管系统持续输送到肿瘤，从而招募激活的免疫系统来对抗肿瘤。激活的免疫系统清除肿瘤中的异物，包括病毒颗粒。这种外来抗原的共同释放增加了抗体的产生和针对肿瘤蛋白的持续抗体反应，以作为由痘苗病毒感染和复制启动的自身免疫疫苗系统发挥作用，随后是细胞裂解、蛋白质渗漏和抗体产生增加。因此，本方法可以提供一种综合方法，可应用于具有免疫豁免肿瘤位点作为病毒、细菌和哺乳动物细胞生长的特权位点的所有肿瘤系统，这可以导致宿主自身免疫系统的一部分清除肿瘤。 .

在其他实施方案中，提供了免疫对象的方法，该方法包括向对象施用表达一种或多种抗原的微生物，对象将针对这些抗原产生免疫应答。免疫抗原可以是微生物的内源性抗原，例如用于针对天花进行免疫的痘苗病毒上的痘苗抗原，或者免疫抗原可以是微生物表达的外源性抗原，例如在病毒上表达的流感或HIV抗原。衣壳或细菌细胞表面。因此，本文提供的微生物，包括修饰的痘苗病毒，可用作疫苗。

1.行政

在实施本文提供的方法时，可将微生物施用于受试者，包括具有肿瘤或赘生性细胞的受试者，或待免疫的受试者。施用的微生物可以是本文提供的微生物或已知用于施用给受试者的任何其他微生物，例如，已知用于施用给受试者的治疗性施用的任何已知微生物，包括抗原性微生物，例如已知用于疫苗接种的任何微生物。在一些实施方案中，施用的微生物是具有诸如致病性减弱、毒性低、肿瘤优先积聚、激活针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、高免疫原性、复制能力以及表达外源蛋白和组合的能力等特性的微生物其中。 .

El. 施用微生物之前的步骤

在一些实施例中，一个或多个步骤可在将微生物施用于受试者之前进行。可以进行许多上述步骤中的任何步骤，包括但不限于诊断受试者患有适合微生物递送的病症、确定受试者的免疫能力、免疫受试者、用化学治疗剂治疗受试者、治疗受试者对受试者进行放射治疗或手术治疗。

对于涉及出于治疗目的将微生物给予荷瘤受试者的实施方案，受试者通常先前被诊断患有肿瘤病症。诊断方法还可以包括确定肿瘤病症的类型、确定肿瘤病症的阶段、确定受试者中一种或多种肿瘤的大小、确定受试者淋巴结中转移细胞或肿瘤细胞的存在或不存在。确定包括受试者中转移的存在。向个体施用微生物的治疗方法的一些实施方案可包括确定原发性肿瘤的大小或肿瘤疾病的阶段以及原发性肿瘤的大小是否等于或大于阈值体积的步骤。或者如果肿瘤疾病的阶段处于或高于阈值阶段，则向受试者施用微生物。在类似的实施方案中，如果原发性肿瘤的大小低于阈值体积或者如果肿瘤疾病的阶段处于或低于阈值阶段，则微生物尚未施用于受试者；此类方法可包括监测受试者直到肿瘤的大小或肿瘤疾病的阶段达到阈值，然后将微生物施用于受试者。阈值可能因多种因素而异，包括肿瘤的生长速度、微生物感染肿瘤的能力以及个体的免疫能力。一般而言，阈值大小将是并且通常是足以允许微生物在肿瘤内或附近积累和复制而不被宿主免疫系统完全消除的大小，以维持微生物感染很长时间。足以使宿主对肿瘤细胞产生免疫反应，通常大约一周或更长时间，大约十天或更长时间，或者大约两周或更长时间。病毒如痘苗病毒的示例性阈值肿瘤大小至少约为 100 毫米。^3个, 至少约 200 毫米^3个, 至少约 300 毫米^3个, 至少约 400 毫米^3个, 至少约 500 毫米^3个, 至少约 750 毫米^3个, 至少约 1000 毫米^3个或至少约 1500 毫米^3个.肿瘤疾病的早期阶段也可以根据许多因素而变化，包括特定肿瘤疾病分期的具体要求、肿瘤疾病生长的侵袭性、生物体感染肿瘤或转移的能力。主题的状态。免疫能力。通常，阈值阶段是足以使微生物在肿瘤或转移灶中积累和复制而不被宿主免疫系统完全清除的阶段，并且通常也足够大以致于微生物感染持续很长时间。 .足以使宿主对肿瘤细胞产生免疫反应，通常大约一周或更长时间，大约十天或更长时间，或者大约两周或更长时间。示例性临界阶段包括超过最低阶段的任何阶段（例如，I 期或等效阶段），或原发肿瘤大于阈值大小的任何阶段，或检测到转移细胞的任何阶段。

在其他实施例中，在将微生物给予对象之前，可以确定对象的免疫能力。本文提供的向受试者施用微生物的方法可包括引发或增强受试者的免疫反应。因此，在将微生物施用于个体之前，可以确定个体引发免疫反应的能力。本领域已知的多种免疫能力测试中的任何一种都可以在本文提供的方法中进行。免疫能力测试的例子可以是 ABO 血凝滴度 (IgM)、白细胞粘附缺陷 (LAD)、粒细胞功能 (NBT)、T 和 B 细胞定量、破伤风抗体滴度、唾液 IgA、皮肤试验、扁桃体、补体水平 C3 和因子 B水平和淋巴细胞计数。本领域技术人员可以根据受试者的免疫能力水平、微生物的免疫原性以及任选地待治疗的肿瘤疾病的免疫原性来确定将微生物给予受试者的可取性。通常，如果本领域普通技术人员可以确定受试者有足够的能力引发针对微生物的免疫反应，则受试者可以被认为是有免疫能力的。

在一些实施方案中，可以在根据本文提供的方法向受试者施用微生物之前免疫受试者。免疫可用于增强受试者产生针对微生物的免疫应答的能力或增加受试者可以产生针对微生物的免疫应答的速率。免疫也可用于降低微生物致病性的风险。在一些实施方案中，可以用类似于待施用的治疗性微生物的免疫微生物进行免疫。例如，免疫微生物可以是治疗微生物的无复制能力的变体。在其他实施方案中，免疫物质可以被待施用的治疗性微生物消化。针对已知微生物对个体进行免疫的多种方法在本领域中是已知的并且可以在本文中使用。在一个例子中，用例如 1 微克补骨脂素和 365 nm 紫外线处理 4 分钟的痘苗病毒可以使复制无能力。备选地，可以选择微生物以与受试者先前已经针对其免疫的微生物相同或相似，如在儿童疫苗接种中。

在另一个实施方案中，可以在没有癌症治疗的先前阶段如化学疗法、放射疗法或手术切除肿瘤和/或转移瘤的情况下将微生物施用于受试者。本文提供的方法利用微生物侵入肿瘤或在肿瘤附近定殖的能力，在肿瘤细胞可以保护肿瘤细胞免受受试者免疫系统的影响；然后微生物可以在这样的免疫保护区域中增殖，并且还引起肿瘤抗原在个体免疫系统可以识别肿瘤抗原并产生免疫反应的位点处从肿瘤中释放，通常是持续释放。在此类方法中，存在足够大的肿瘤或充分发展的免疫保护状态可能有利于将微生物成功递送至肿瘤和产生足够的肿瘤抗原。当通过手术切除肿瘤时，微生物可能无法在其他肿瘤细胞（例如，小的转移瘤）中定殖，因为这些细胞可能尚未成熟到足以产生微生物可以在其中存活和繁殖的免疫保护环境。微生物可以定殖肿瘤细胞。 ，细胞的数量或质量的大小可能太小，微生物无法引起肿瘤抗原的持续释放，从而使宿主产生抗肿瘤免疫反应。因此，例如，本文提供了治疗肿瘤或肿瘤疾病的方法，其中将微生物施用于患有肿瘤或肿瘤疾病但不去除原发性肿瘤的个体，或施用于至少部分患有肿瘤或肿瘤疾病的个体。肿瘤或肿瘤细胞可能有意留在受试者体内。在其他典型的癌症治疗中，例如化学疗法或放射疗法，此类程序通常具有削弱受试者免疫系统的副作用。通过化学疗法或放射疗法对受试者进行的这种治疗可能会降低受试者产生抗肿瘤免疫反应的能力。例如，本文提供了治疗肿瘤或肿瘤疾病的方法，其中将微生物施用于患有肿瘤或肿瘤疾病的受试者而不用免疫抑制疗法如化学疗法或放射疗法来治疗受试者。

在一个替代实施方案中，在向受试者施用微生物之前，可以用不杀死原发性肿瘤或抑制受试者免疫系统的一个或多个癌症治疗步骤来治疗受试者。正在开发各种更复杂的癌症治疗方法，无需手术切除或免疫抑制治疗即可治疗肿瘤。示例性方法包括施用降低肿瘤或肿瘤细胞增殖速率而不抑制免疫系统的化合物（例如，通过施用肿瘤抑制化合物或通过施用肿瘤细胞特异性化合物），或施用血管生成抑制化合物.因此，涉及向受试者施用微生物的联合方法可以进一步改善癌症治疗。因此，本文提供了向受试者施用微生物的方法，以及例如在施用减缓肿瘤生长而不抑制受试者免疫系统的化合物或抑制肿瘤血管形成的化合物之前或之后。

B. 行政类型

可以使用向受试者施用微生物的任何模式，只要施用模式允许微生物进入肿瘤或转移瘤。给药途径可能包括但不限于静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部、肿瘤内、多次穿刺（例如，与天花疫苗一起使用）、吸入、鼻内、口服、腔内（例如与天花疫苗一起使用）疫苗），（例如，通过导管输送膀胱，通过栓剂或灌肠剂输送肠道），听觉或眼部输送。本领域技术人员可以选择与受试者和微生物相容的任何给药途径，这也可能导致微生物到达肿瘤和/或转移。给药途径可由本领域技术人员根据多种因素中的任何一种来选择，包括疾病类型、肿瘤类型和药物组合物中包含的特定微生物。例如，可以通过弹道递送如胶体分散系统递送至目标部位，或者可以通过注入动脉进行全身递送。

用剂量

给药方案可以是多种方法和量中的任一种并且可以由本领域技术人员根据已知的临床因素来确定。正如医学领域众所周知的那样，任何给定患者的剂量可能取决于许多因素，包括受试者的种类、大小、体表面积、年龄、性别、免疫能力和总体健康状况。施用的特定微生物、持续时间和给药途径、疾病的类型和阶段，例如肿瘤的大小，以及其他化合物，例如伴随给药的药物。除了上述因素之外，这样的浓度还可能受到微生物的感染性和微生物的性质的影响，这可以由本领域技术人员确定。至少这里提供的方法中使用的一些病毒可能比这里使用的细菌更具传染性。因此，在本方法的一些实施例中，可以以低于细菌的水平施用病毒。在本方法中，合适的微生物最低剂量水平可以是足以使微生物在肿瘤或转移瘤中存活、生长和复制的水平。向 65 公斤重的人施用病毒的最小样本可能包括至少约 5 × 10^5个噬菌斑形成单位 (pfu)，至少约 1 × 10^6个pfu，头发少约 5 × 10^6个pfu，头发少约 1 × 10⁷pfu 或至少约 1 × 10^8个呸。向 65 kg 的人施用细菌的示例性最小量可包括至少约 5 × 10^6个菌落形成单位 (cfu)，至少约 1 × 10⁷cft，至少约 5 × 10⁷cfu，头发少约1×10^8个cfu 或至少约 1 × 10⁹cfu 在本方法中，微生物的最大有用剂量水平可以是对宿主无毒的水平、不会引起 3x 或更多脾肿大的水平、不会在正常组织或器官中导致菌落或斑块的水平。约 1 天或约 3 天后或约 7 天后。将病毒施用于 150 磅的人的示例性峰可能包括不超过约 5 × 10¹⁰pfu，不超过约 1 × 10¹⁰pfu，不超过约 5 × 10⁹pfu，不超过约 1 × 10⁹pfu，或不超过约 1 × 10^8个呸。向 65 公斤重的人施用细菌的示例性最大值可能包括不超过约 5 × 10¹¹pfu，不超过约 1 × 10¹¹pfu，不超过约 5 × 10¹⁰pfu，不超过约 1 × 10¹⁰pfu，或不超过约 1 × 10⁹ufp

D. 主管部门数量

本文提供的方法可涉及向受试者单次施用微生物或向受试者多次施用微生物。在一些实施方案中，单次施用足以在肿瘤中建立微生物，其中微生物可以增殖并引发或加强受试者的抗肿瘤反应；此类方法不需要额外施用微生物来引发或改善个体的抗肿瘤反应，这可能导致例如抑制肿瘤生长、抑制生长或转移、减小肿瘤大小或转移、消除肿瘤或转移，抑制或预防肿瘤疾病的复发或肿瘤再形成，或癌症的其他治疗作用。在其他实施例中，微生物可以在不同时间施用，通常在时间上间隔至少一天。当之前的给药可能无法有效地将微生物递送至肿瘤或转移灶时，单独给药可增加将微生物递送至肿瘤或转移灶的可能性。单独给药可能会增加肿瘤或转移瘤中微生物可以繁殖的部位，或者可能会增加肿瘤中积累的微生物的滴度，这可能会增加抗原或其他化合物从肿瘤中释放的面积，从而提高能力诱导或增强宿主的抗肿瘤免疫反应，也可能增加基于微生物的肿瘤溶解或肿瘤细胞死亡的速率。单独施用微生物可进一步延长个体针对微生物抗原的免疫反应，这可延长宿主对微生物已在其中积累的肿瘤或转移瘤的免疫反应，并可增加感染的可能性。导致宿主产生免疫反应对抗肿瘤。 .

当进行单独给药时，每次给药的剂量水平可以与其他给药剂量水平相同或不同。在一个实施例中，所有的给药剂量都是相同的。在其他实施方案中，第一剂量水平可以是比一个或多个后续剂量水平更高的剂量水平，例如B. 比后续剂量大至少 10 倍、至少 100 倍或至少 1,000 倍。在其中第一个剂量大于一个或多个后续剂量的单独给药方法的一个实例中，所有后续剂量可以是相同的相对于第一次给药更小的量。

单独的施用可以包括任何数量的两次或更多次施用，包括两次、三次、四次、五次或六次施用。根据本领域已知的用于监测治疗方法的方法和本文提供的其他监测方法，本领域技术人员可以容易地确定要进行的给药次数或进行一次或多次额外给药的可取性。因此，本文提供的方法包括向受试者施用一次或多次微生物的方法，其中施用的次数可以通过监测受试者并基于对照的结果确定是否施用一种或多种微生物来确定。更多额外的主管部门。是否提供一次或多次额外给药的决定可基于多种监测结果，包括但不限于肿瘤生长或肿瘤生长抑制的证据、新转移的出现或转移的抑制、抗体滴度 抗微生物剂、受试者的抗肿瘤抗体滴度、受试者的一般健康状况、受试者的体重、仅在肿瘤和/或转移中存在微生物、在正常组织或器官中存在微生物。

两次给药之间的时间段可以是多种时间段中的任何一种。两次给药之间的时间间隔可能取决于许多因素，包括与给药次数相关的控制步骤、一个人产生免疫反应所需的时间、一个人产生免疫力以消除免疫反应所需的时间。来自正常组织的微生物，或微生物在肿瘤或转移中增殖的时间跨度。在一个例子中，持续时间可以是受试者引发免疫反应所花费的时间量的函数；例如，该时间段可以长于受试者产生免疫反应的时间段，例如一周以上、十天以上、两周以上或一个月以上；在另一个例子中，该时间段可以小于受试者产生免疫反应的时间段，例如小于一周、小于十天、小于两周或小于一个月。在另一个例子中，该时间可能是一个人从正常组织中清除微生物所需时间的函数；例如，该时间可能比人从正常组织中杀死微生物所花费的时间更长，例如超过一天、超过两天、超过三天、超过五天或超过大约一周..在另一个例子中，时间长度可以是微生物在肿瘤或转移中生长的时间长度的函数；例如，该时间段可以长于施用表达可检测标记物的微生物后可检测信号出现在肿瘤或转移灶中的时间，例如约3天、约5天、约一周、约10天，大约两周或一个月。

Is. 联合管理

还提供了施用另外的治疗物质例如另一种治疗性微生物或治疗性化合物的方法。这些可以与第一种微生物同时、顺序或间歇施用。额外的治疗物质可以与微生物或其基因产物相互作用，或者额外的治疗物质可以独立于微生物起作用。

一、处理多种微生物。

提供了将两种或更多种微生物施用于个体的方法。施用可以是同时的、顺序的或间歇的。多种微生物可以作为单一组合物或作为两种或更多种组合物施用。两种或更多种微生物可包括至少两种细菌、至少两种病毒、至少两种真核细胞，或选自细菌、病毒和真核细胞的两种或更多种。多种微生物可以作为包含微生物的组合物的组合和/或作为用于给药的包装试剂盒提供并且任选地包括其说明书。组合物可包含配制用于单剂量给药（即直接给药）的微生物，并且可能需要稀释或其他添加剂。

在一个实施方案中，至少一种微生物是本文提供的修饰微生物，其具有诸如低致病性、低毒性、优先肿瘤积累、激活针对肿瘤细胞的免疫应答的能力、免疫原性、复制能力等特性。合成外源蛋白并表达它们的组合的能力。微生物可以在大约相同的时间施用，或者它们可以在不同的时间施用。微生物可以以相同的组合物或施用方法施用，或者它们可以以不同的组合物或通过不同的施用方法施用。

在一个实例中，可以将细菌和病毒施用于受试者。细菌和病毒可以同时或不同时间施用。例如，可以在施用细菌之前施用病毒，或者可以在施用病毒之前施用细菌；通常，在施用细菌之前施用病毒。如本文所提供的，与仅施用细菌的方法相比，在向受试者施用细菌之前向受试者施用病毒可以增加可以在肿瘤中积累和/或增殖的细菌的量。

因此，本文提供的涉及在施用细菌之前施用病毒的方法允许施用比在施用细菌的方法中施用更低剂量水平的细菌。施用细菌。在施用病毒的同时或之前施用。例如，在一些实施方案中，待施用的细菌可能具有一种或多种限制细菌用途的特性，此类特性可包括但不限于毒性、低肿瘤积累特异性和有限的增殖能力。待施用的具有一种或多种限制特性的细菌可能需要以较低剂量水平施用或可能需要有助于肿瘤特异性积累和/或增殖。本文提供了施用此类具有限制性特性的细菌的方法，其中在施用细菌之前，施用病毒使得受限制的细菌可以以较低水平施用、以更高的特异性定位于肿瘤和/或具有更大的在肿瘤中增殖的能力。

施用之间的时间段可以是实现所需效果的任何时间段，这可以由本领域技术人员确定。不同微生物给药间隔期的选择可以根据与选择相同微生物给药间隔期相似的参数来确定，包括后续步骤的结果、受试者产生免疫力的时间段反应，即个体从正常组织中清除微生物所需的时间，或微生物繁殖或转移至肿瘤所需的时间。在一个例子中，持续时间可以是受试者引发免疫反应所花费的时间量的函数；例如，该时间段可以长于受试者产生免疫反应的时间段，例如一周以上、十天以上、两周以上或一个月以上；在另一个例子中，该时间段可以小于受试者产生免疫反应的时间段，例如小于一周、小于十天、小于两周或小于一个月。在另一个例子中，该时间可能是一个人从正常组织中清除微生物所需时间的函数；例如，该时间可能比人从正常组织中杀死微生物所花费的时间更长，例如超过一天、超过两天、超过三天、超过五天或超过大约一周..在另一个例子中，时间长度可以是微生物在肿瘤或转移中生长的时间长度的函数；例如，该时间段可以长于施用表达可检测标记物的微生物后可检测信号出现在肿瘤或转移灶中的时间，例如约3天、约5天、约一周、约10天，大约两周或一个月。在一个实例中，可以首先施用病毒并且可以在病毒施用后大约5天施用细菌。在另一个实例中，可以首先施用病毒，并且可以在受试者的肿瘤中检测到可检测的病毒编码的基因产物之后施用细菌，任选地如果可检测的病毒编码的基因产物仅在受试者的肿瘤中检测到。

二.治疗化合物

除了向受试者施用一种或多种微生物之外，该方法还可以包括向受试者施用一种或多种治疗化合物。治疗化合物可以独立地或与微生物一起发挥肿瘤治疗作用。可以独立起作用的治疗剂包括已知抑制肿瘤生长、抑制转移的生长和/或形成、减小肿瘤或转移的大小、根除肿瘤或转移而不降低微生物的能力的多种化学治疗化合物。在肿瘤中积累，在肿瘤中复制，并在受试者中引发或加强抗肿瘤免疫反应。

与微生物联合作用的治疗性化合物包括，例如，改变微生物表达的化合物，或可与微生物表达的基因相互作用的化合物，或可抑制微生物生长的化合物，包括有毒化合物。微生物。可以与微生物相互作用的治疗化合物包括例如增强微生物的增殖、毒性、肿瘤细胞杀伤或免疫反应诱导特性的治疗化合物，并且还可以包括例如减少增殖的治疗化合物B. 微生物的毒性或细胞杀伤特性。因此，本文提供了向受试者施用一种或多种治疗性化合物的方法，所述治疗性化合物可以与微生物联合作用以增强微生物的增殖、毒性、肿瘤细胞杀伤或免疫应答诱导特性。本文还提供了向受试者施用一种或多种治疗性化合物的方法，所述治疗性化合物可以与微生物联合作用以降低微生物的细胞增殖、毒性或破坏性。

在一个实施方案中，可以与微生物联合作用以增强微生物的增殖、毒性、肿瘤细胞杀伤或免疫反应诱导特性的治疗化合物是可以改变基因表达的化合物，其中改变的基因表达导致增加可能导致人体内肿瘤细胞死亡或抗肿瘤免疫反应增强。例如，改变基因表达的化合物可引起一种或多种微生物基因表达的增加或减少，包括内源微生物基因和/或外源微生物基因。例如，改变基因表达、诱导或增加微生物中基因转录的化合物，例如。 B. 可引起细胞裂解或细胞死亡、可引发免疫反应、可催化化合物前体药物转化或可抑制肿瘤细胞基因表达的外源基因。任何能够改变基因表达的化合物都是本领域已知的，包括IPTG和RU486。表达可以上调的基因的例子包括蛋白质和 RNA 分子，包括毒素、可以将前体药物转化为抗肿瘤药物的酶、细胞因子、转录调节蛋白、siRNA 和核酶。在另一个例子中，改变基因表达的化合物可以抑制或减少微生物中基因的转录，例如。 B. 可以降低微生物毒性或减少微生物生长的外源基因。可降低或抑制基因表达的多种化合物，包括siRNA化合物、转录抑制剂或转录激活剂抑制剂，可用于本文提供的方法中。表达可被下调的基因的例子包括蛋白质和 RNA 分子，包括抑制核苷酸裂解、合成或增殖的微生物蛋白质或 RNA，以及抑制细胞死亡、免疫反应性裂解或微生物复制的细胞蛋白质或 RNA 分子

在另一个实施方案中，可与微生物联合作用以增强微生物的增殖、毒性、肿瘤细胞杀伤或免疫反应诱导特性的治疗性化合物是可与微生物表达的基因产物相互作用的化合物。以及相互作用如何导致患者的肿瘤细胞杀伤或抗肿瘤免疫反应增加。能够与微生物表达的基因产物相互作用的治疗性化合物可以包括，例如，前药或其他化合物，其在受试者施用的形式中具有很少或没有毒性或其他生物活性，但在与表达的基因相互作用后.微生物表现出的产物，化合物可表现出导致肿瘤细胞死亡的特性，包括但不限于细胞毒性、诱导细胞凋亡的能力或引发免疫反应的能力。多种前药样物质在本领域中是已知的，并且在本文别处描述了一组示例性的此类化合物，其中此类化合物包括更昔洛韦、5-氟尿嘧啶、6-甲基嘌呤脱氧核苷、头孢菌素多柔比星、4-[(2-氯乙基) (2-mesuloxyethyl)amino]benzoyl-L-glutamic acid, acetaminophen, indole-3-acetic acid, CB1954, 7-ethyl-10-[4-(1-piperidino)-1-piperidino]carbonyloxycamptothecin, 双（2 -chloroethyl)amino-4-hydroxyphenylaminomethanone 28, 1-chloromethyl-5-hydroxy-1,2-dihydro-3H-benz[e]indole, epirubicin glucuronide, 5'-deoxy-5-fluorouridine, arabinoside of cytosine and linamarin.

在另一个实施方案中，可以与微生物联合作用以降低微生物的细胞增殖、毒性或破坏性的治疗化合物是抑制微生物复制、抑制微生物毒素或引起微生物杀死的化合物。可抑制微生物复制、抑制微生物毒素或导致微生物杀死的治疗性化合物通常可包括可阻断微生物生命周期中的一个或多个步骤的化合物，包括但不限于抑制微生物复制的化合物。 RNA 转录、病毒外壳蛋白组装、外膜或多糖组装。能够阻断微生物生命周期中的一个或多个步骤的多种化合物是本领域已知的，包括所有已知的抗生素、微生物DNA聚合酶抑制剂、微生物RNA聚合酶抑制剂、影响微生物复制的蛋白质-DNA或RNA 转录的调节因子。在一个实例中，当微生物是细菌时，化合物可以是抗生素。在另一个例子中，微生物可能含有编码微生物生命周期蛋白的基因，例如 DNA 聚合酶或 RNA 聚合酶，该基因可能被化合物抑制，该化合物可能对宿主生物体有毒或无毒。

F. 主题状态

在另一个实施例中，本文提供的用于将微生物施用于受试者的方法可以对处于多种状态中的任一种的受试者进行，包括麻醉的受试者、警觉的受试者、体温升高的受试者、患有体温升高、体温降低或受试者的其他已知影响微生物在肿瘤中积累的情况。如本文所提供的，已发现与未麻醉的受试者相比，麻醉的受试者可能具有降低的微生物在肿瘤中的积累速率。此外，本文已经提供，已经发现与具有正常体温的受试者相比，具有降低的体温的受试者可以具有降低的微生物在肿瘤中的积累速率。因此，本文提供了向受试者施用微生物的方法，该方法可包括向受试者施用微生物，其中受试者未处于麻醉状态，例如全身麻醉；例如，受试者可能处于局部麻醉或未麻醉状态。本文还提供了向受试者施用微生物的方法，该方法可包括向体温改变的受试者施用微生物，其中体温的变化可能影响微生物在肿瘤中积累的能力。通常，体温下降会降低微生物在肿瘤中积聚的能力。因此，在一个示例性实施例中，提供了一种向受试者施用微生物的方法，该方法包括将受试者的体温升高至高于正常温度并向受试者施用微生物，由此微生物可以在肿瘤中积聚。相对于微生物在正常体温受试者的肿瘤中积聚的能力，体温较高的受试者更容易积聚。

2. 监视

本文提供的方法还可包括监测受试者、监测肿瘤和/或监测施用于受试者的微生物的一个或多个步骤。几个监测步骤中的任何一个可以包括在本文提供的方法中，包括但不限于监测肿瘤大小、监测抗（肿瘤抗原）抗体滴度、监测转移的存在和/或转移的大小，淋巴结的控制，人的体重或其他健康指标的控制，包括血液或尿液标记物，抗（微生物抗原）抗体滴度的控制，可检测基因产物的微生物表达的控制以及直接监测受试者肿瘤、组织或器官中的微生物滴度。

监测的目的可能只是为了评估受试者的健康状况或受试者治疗的进展，或者可能是为了确定是否或何时需要额外施用相同或另一种微生物，或者是否是这种情况，向受试者施用化合物，其中该化合物可以起到增加治疗方法的功效的作用，或者该化合物可以起到降低施用给受试者的微生物的致病性的作用。

微生物基因表达的监测

在一些实施例中，本文提供的方法可涉及监测由微生物表达的一种或多种基因。微生物，例如本文提供的那些或本领域已知的那些，可以表达一种或多种可检测的基因产物，包括但不限于可检测的蛋白质。

如本文所提供的，对微生物中表达的可检测基因产物的测量可以提供对象中存在的微生物量的准确测定。如本文进一步提供的，可检测基因产物位置的测量，例如通过成像方法，包括断层摄影方法，可以确定微生物在受试者体内的位置。因此，本文提供的方法（包括监测可检测的微生物基因产物）可用于确定受试者的一个或多个器官或组织中微生物的存在或不存在和/或微生物在个体的一个或多个器官或组织中的存在或不存在。肿瘤或确定个体的转移。此外，本文提供的方法涉及监测可检测的微生物基因产物，可用于确定一个或多个器官、组织、肿瘤或转移灶中存在的微生物的效价。涉及监测个体微生物位置和/或滴度的方法可用于确定微生物的致病性；因为微生物感染，特别是正常组织和器官的感染程度，可以指示探针的致病性，所以可以使用监测对象中微生物的位置和/或数量的方法来确定微生物的致病性。因为本文提供的方法可用于监测受试者体内任何特定位置处的微生物数量，涉及监测受试者体内微生物位置和/或效价的方法可在多个使用点进行。因此，它可以确定受试者体内的微生物复制速率，包括受试者的一个或多个器官或组织中的微生物复制速率；因此，监测微生物基因产物的方法可用于确定微生物的复制能力。本文提供的方法还可用于量化存在于各种器官或组织和肿瘤或转移瘤中的微生物数量，因此可指示微生物在个体中优先积累的程度；因此，本文提供的用于监测微生物基因产物的方法可用于确定微生物在肿瘤中积累或从正常组织或器官转移的能力的方法。因为在本文提供的方法中使用的微生物可以在肿瘤中或在肿瘤的多个部位积累并且还可以在转移灶中积累，所以本文提供的方法可以用于监测微生物基因产物的大小以确定肿瘤或肿瘤。受试者中存在的转移数量。随着时间的推移监测肿瘤或转移中微生物基因产物的存在可用于评估肿瘤或转移的变化，包括肿瘤的生长或缩小或新转移的发展或转移的消失，并且可以也被使用。以确定肿瘤的生长或收缩率，或新转移的发展，或转移的消失，或肿瘤生长或收缩率的变化，或新转移的发展，或转移的消失。因此，用于监测微生物基因产物的方法可用于监测个体的肿瘤疾病或通过确定肿瘤的生长或收缩速率或新转移的发展或肿瘤的消失来确定治疗肿瘤疾病的有效性。转移或肿瘤生长或收缩率的变化，或新转移的发展或转移的消失。

可在本文提供的监测方法中检测多种可检测蛋白质中的任一种；此类可检测蛋白质的示例性和非限制性列表包括多种荧光蛋白（例如，绿色荧光蛋白）中的任何一种、多种荧光素酶、转铁蛋白或其他铁结合蛋白中的任何一种； o 受体、结合蛋白和抗体，其中与受体、结合蛋白或抗体特异性结合的化合物可以是可检测试剂或可以用可检测物质（例如放射性核素或细胞形成剂）标记. 图片）。

B. 肿瘤大小的随访

本文还提供了用于监测肿瘤和/或转移的大小和位置的方法。可以通过本领域已知的多种方法监测肿瘤大小和/或转移，包括外部评估方法或断层摄影或磁成像方法。除了本领域已知的方法，本文提供的方法，例如监测微生物基因表达，可用于监测肿瘤大小和/或转移。

跟踪不同时间点的大小可以提供关于肿瘤或转移的大小增加或减少的信息，并且还可以提供关于受试者中额外肿瘤和/或转移的存在的信息。在多个时间点监测肿瘤大小可以提供关于受试者肿瘤疾病发展的信息，包括受试者肿瘤疾病治疗的功效。

W. 抗体滴度监测

本文提供的方法还可以包括监测受试者中的抗体滴度，包括响应于对受试者施用微生物而产生的抗体。在本文提供的方法中施用的微生物可以引发针对来自内源微生物的抗原的免疫应答。在本文提供的方法中施用的微生物也能够引发针对微生物表达的外来基因的免疫应答。在本文提供的方法中施用的微生物也可以引发对肿瘤抗原的免疫反应。针对微生物抗原、外源微生物表达的基因产物或肿瘤抗原的抗体滴度的控制可用于监测微生物毒性、监测治疗方法的功效或监测基因产物水平的方法。 /或或收获。

在一个实施方案中，对照抗体滴度可用于监测微生物的毒性。针对微生物的抗体滴度可能会在个体施用微生物后随时间变化；在某些时间点，低抗（微生物抗原）抗体滴度可能表明毒性增加，而在其他时间点，高抗（微生物抗原）抗体滴度。抗体滴度可能表明毒性增加。本文提供的方法中使用的微生物可以是免疫原性的，因此可以在将微生物施用于受试者后不久引发免疫反应。一般而言，如果人的免疫系统能够从所有正常器官或组织中清除微生物，则人的免疫系统能够快速针对其产生强烈免疫反应的微生物可能是低毒性微生物。因此，在一些实施方案中，在将微生物施用于受试者后不久针对微生物抗原的抗体的高效价可能指示微生物的低毒性。相反，免疫原性不高的微生物可以感染宿主生物体而不会引起强烈的免疫反应，这会导致微生物对宿主的毒性增加。因此，在一些实施方案中，在将微生物施用于受试者后不久针对微生物抗原的抗体的高效价可能指示微生物的低毒性。

在其他实施方案中，抗体滴度监测可用于监测治疗方法的功效。在本文提供的方法中，抗体效价，例如抗(肿瘤抗原)抗体效价，可以指示治疗方法的功效，例如治疗肿瘤疾病的治疗方法。本文提供的治疗方法可涉及诱导或增强针对肿瘤和/或转移的免疫应答。因此，通过监测抗（肿瘤抗原）抗体的滴度，可以监测治疗方法在引发或加强针对肿瘤和/或转移的免疫反应中的功效。本文提供的治疗方法还可以涉及向受试者施用能够定位于肿瘤并引发或加强抗肿瘤免疫反应的微生物。因此，可以监测宿主对肿瘤或转移瘤中积累的微生物产生免疫反应的能力，这可能表明受试者也产生了抗肿瘤免疫反应，或者可能表明它可能是受试者产生抗肿瘤免疫反应或可能表明受试者能够产生抗肿瘤免疫反应。

在其他实施方案中，对照抗体滴度可用于控制用于生产和/或收获的基因产物或抗体的量。如本文所提供的，该方法可用于生产蛋白质、RNA分子或其他化合物，这些化合物在已经在肿瘤中积累的微生物中表达外源基因。此外，本文提供了针对蛋白质、RNA分子或由已在肿瘤中积累的微生物通过外源基因表达产生的其他化合物产生抗体的方法。监测针对蛋白质、RNA 分子或其他化合物的抗体滴度可以指示肿瘤中积累的微生物产生蛋白质、RNA 分子或其他化合物的水平，也可以直接指示特定抗体的水平那种蛋白质。 、RNA、显示分子或其他化合物。

D. 一般健康诊断的跟进

本文提供的方法还可以包括用于监测受试者健康的方法。本文提供的一些方法是治疗方法，包括治疗肿瘤疾病的方法。如本领域已知的，可以使用对象健康的监测来确定治疗方法的功效。本文提供的方法还可以包括向受试者施用微生物的步骤。监测对象的健康可用于确定给予对象的微生物的致病性。如本领域已知的，多种健康诊断方法中的任何一种都可用于监测疾病，例如肿瘤性疾病、传染病或与免疫系统相关的疾病。例如，一个人的体重、血压、心率、呼吸、颜色、温度或其他可观察到的状况可以指示一个人的健康状况。此外，受试者样品中一种或多种成分的存在或不存在或含量可指示受试者的健康。典型的样本可以包括血液和尿液样本，其中可以确定一种或多种成分的存在或不存在或含量，例如，通过进行诊断性血液测试或尿液分析。指示个体健康的示例性成分包括但不限于白细胞计数、血细胞比容、c-反应蛋白浓度。

Es. 与治疗相协调的随访

本文还提供了用于监测治疗的方法，其中治疗决定可以基于监测结果。本文提供的治疗方法可包括向受试者施用微生物，优选地，其中微生物能够积聚肿瘤和/或转移瘤，并且其中微生物能够引发或加强免疫反应。此类治疗方法可涉及多种步骤，包括给定微生物的多次给药、第二种微生物的给药或治疗化合物的给药。对受试者施用的微生物或化合物的量、时间或类型的确定可以基于监测受试者的一个或多个结果。例如，受试者的抗体滴度可用于确定是否需要施用微生物或化合物、施用的微生物或化合物的量以及施用的微生物或化合物的类型，其中，例如，低抗体滴度可能表明施用额外的微生物、另一种微生物或治疗性化合物（例如诱导微生物中基因表达的化合物）的可取性。在另一个实例中，受试者的一般健康状况可用于确定是否需要施用微生物或化合物、待施用的微生物或化合物的量以及待施用的微生物或化合物的类型。其中，例如，受试者健康的发现可表明施用额外的微生物、另一种微生物或治疗性化合物如诱导微生物基因表达的化合物的可取性。在另一个实例中，监测可检测的微生物表达的基因产物可用于确定是否需要施用微生物或化合物、待施用的微生物或化合物的量以及待施用的微生物或化合物的类型。此类监测方法可用于确定治疗方法是否有效、治疗方法是否对受试者具有致病性、微生物是否已在肿瘤或转移中积累以及微生物是否已积累或不。在正常组织或器官中。其他治疗方法的适用性和形式可以从这些发现中得出。

在一个实施例中，确定一种治疗方法是否有效可用于推断其他治疗方法。如本文所提供的或本领域已知的，多种监测方法中的任何一种都可用于确定治疗方法是否有效。如果后续方法表明治疗方法有效，则可以决定继续当前的治疗过程，这可能包括额外施用微生物或化合物，或者可以决定不需要这些。额外的主管部门。当监测方法表明治疗方法无效时，监测结果可以提供有关治疗是否应该停止（例如，如果微生物对个体具有致病性）或修改（例如，如果微生物进入肿瘤但不伤害患者）的信息宿主生物但不引起抗肿瘤免疫反应）或频率或数量增加（例如，当很少或没有微生物在肿瘤中积累时）。

在一个例子中，监测可以指示微生物对受试者是致病的。在这种情况下，可以决定终止向受试者施用微生物，向受试者施用减少量的微生物，向受试者施用不同的微生物，或向受试者施用减少微生物的化合物。微生物的致病性。在一个实例中，可以终止施用被确定为病原体的微生物。在另一个例子中，可以降低疑似病原微生物的剂量水平以用于后续给药；在这样的例子的一个版本中，在将病原微生物重新引入受试者之前，可以用另一种微生物预处理受试者，这可以增加病原微生物在肿瘤中积累的能力。在另一个例子中，受试者可能已经被施用对该受试者具有致病性的细菌或病毒；施用所述致病微生物可伴随施用例如抗生素、抗微生物化合物、减轻致病性的化合物（例如，下调裂解基因产物或细胞凋亡的表达的化合物）或影响病原微生物的其他化合物。如本文别处所述，微生物的增殖、毒性或细胞杀伤特性降低。在这样的例子的变化中，可以监测微生物的位置，并且在确定微生物已经在肿瘤和/或转移瘤中而不是在正常组织或器官中积累之后，可以施用抗生素、抗微生物化合物。或者化合物的致病性减弱剂可以被终止并且微生物的致病活性可以被激活或增加，但仅限于肿瘤和/或转移。在所述实例的另一个变型中，在完成抗生素、抗微生物化合物或减轻致病性的化合物的给药后，可进一步监测微生物的存在和/或微生物的致病性并恢复所述化合物的给药。如果微生物被确定对宿主构成威胁，例如，通过扩散到正常器官或组织，将毒素释放到脉管系统中，或具有超出肿瘤或转移的致病作用。

在另一个例子中，监测可以确定微生物是否已经在受试者的肿瘤或转移瘤中积累。在这样的确定之后，可以决定给予患者更多的微生物、另一种微生物或化合物。在一个实例中，监测肿瘤或转移瘤中病毒的存在可用于决定向受试者施用细菌，例如，施用的细菌量可基于病毒的存在和/或量而减少。在肿瘤或转移中。在相关示例中，监测肿瘤或转移中病毒的存在可用于决定何时向患者施用细菌，例如，通过检测存在和/或选择的量可以是病毒来施用细菌在肿瘤或转移中。在另一个例子中，如果化合物可以增强微生物的致病性、增殖或免疫原性，或者如果化合物以其他方式相关，则监测肿瘤中微生物的存在可用于决定是否向受试者施用该化合物能够与微生物一起作用以增强微生物的增殖、毒性、肿瘤细胞杀伤或免疫反应诱导特性；在所述实例的变型中，例如，在不存在所述化合物的情况下，微生物可能具有很小或没有裂解或杀细胞能力；在所述实例的另一个变体中，控制肿瘤或转移中微生物的存在可以与控制正常组织或器官中不存在微生物相结合，当微生物在肿瘤或转移中时施用化合物在正常器官或组织中存在和不存在或基本上不存在转移；在所述实例的另一个变化中，可以控制肿瘤或转移瘤中微生物的量，当微生物以足量存在于肿瘤或转移瘤中时施用化合物。

E. 基因产物和抗体的生产方法

本文提供了微生物和用于生产和使用此类微生物生产外源基因产物和/或生产外源基因产物特异性抗体的方法。这里提供的方法导致生物活性蛋白质的有效重组生产。在EP-A1 1 281 772中公开了当携带rVV-ruc-gfp发光基因融合基因构建体(RVGL9)的痘苗病毒(LIVP株)静脉内注射到裸鼠体内时，病毒颗粒从所有内脏器官被去除.器官在4天内，由发光的消光来确定。相比之下，当在从皮下植入 C6 小鼠神经胶质瘤细胞培养的荷瘤裸鼠中类似地追踪注射的痘苗病毒的命运时，发现病毒颗粒随时间保留在痘苗组织中，导致持续时间长。 LED发光。通过在立体显微镜下观察 GFP 荧光并在低光摄像机下检测荧光素酶催化的光发射，在活体动物中监测同一肿瘤中病毒编码融合蛋白的存在和扩增。在携带皮下 C6 胶质瘤植入物的裸鼠中注射病毒后 4 天检测到肿瘤特异性发光。 rVV-ruc-gfp (RVGL9) 病毒颗粒的肿瘤积聚也在植入 PC-3 人前列腺细胞的皮下肿瘤裸鼠和原位植入 MCF-7 人乳腺肿瘤的小鼠中观察到。此外，将C6小鼠神经胶质瘤细胞颅内植入免疫活性小鼠和将人MB-49膀胱肿瘤细胞植入C57小鼠也受到痘苗病毒的攻击。除了原发性乳腺肿瘤外，在对侧乳腺区域和暴露肺表面的结节中也检测到小的外部转移瘤，表明转移到对侧乳腺和肺。总之，已经显示发光细胞或微生物，例如痘苗病毒，可用于检测和治疗转移性肿瘤。

用发光细菌（沙门氏菌，弧菌、李斯特菌、大肠杆菌) 静脉注射到小鼠体内，在微光成像仪下可以立即在整个动物身上观察到。由于在细菌注射后 24 小时被免疫系统清除，因此在无胸腺 (nu/nu) 和免疫活性 C57 小鼠中未检测到光发射。在植入 C6 神经胶质瘤细胞并长出肿瘤的裸鼠中，动物的光发射在细菌杀死后 24 小时完全消失，类似于没有肿瘤的小鼠。然而，注射后 48 小时，仅从肿瘤区域观察到强烈且增加的光发射。这一观察结果表明肿瘤组织中的细菌持续复制。发光的程度取决于所使用的细菌菌株。在患有前列腺、膀胱和乳腺肿瘤的裸鼠身上也证明了与持续发光相结合的寻找过程。除了原发性肿瘤外，转移性肿瘤也可以表示为乳腺肿瘤模型。在患有膀胱肿瘤的免疫活性 C57 小鼠和患有脑胶质瘤植入物的 Lewis 小鼠中也观察到肿瘤特异性光发射。发光细菌一旦进入肿瘤，就不会被释放到循环中，也不会在随后植入同一动物体内的肿瘤中重新定殖。此外，还发现表达 Ruc-GFP 融合蛋白的哺乳动物细胞在注入血流后在胶质瘤肿瘤中增殖。这些发现为设计多功能病毒载体铺平了道路，这些病毒载体可用于基于信号的肿瘤检测，例如光发射，用于抑制肿瘤发展和血管生成，例如通过淬灭光，以及用于哺乳动物的发育.细菌和肿瘤变得有用的是细胞。靶向系统结合治疗性基因结构来治疗癌症。这些系统具有以下优点： (a) 它们专门针对肿瘤而不影响正常组织； (b) 治疗基因构建体的表达和分泌可以任选地处于允许分泌被开启或关闭的诱导型启动子的控制下； (c) 递送系统在肿瘤内的位置可以在激活基因表达和蛋白质递送之前通过直接可视化来验证。

如本文所提供的，上述基于细菌、病毒和真核细胞在肿瘤中积累的系统可用于简单、快速和廉价地生产蛋白质和其他源自克隆核苷酸序列的生物化合物。该系统还可用于在同一动物中同时过量生产多肽、RNA 或其他生物化合物（在肿瘤组织中）和针对这些化合物的抗体（在血清中）。如本文所述，痘苗病毒等微生物在静脉注射后可以进入动物的肿瘤，并由于肿瘤的免疫特权状态而优先在肿瘤组织中复制，从而过量产生由导入肿瘤的基因编码的蛋白质。获得肿瘤组织后，可以通过简单的程序从肿瘤匀浆中分离出局部和过表达的蛋白质。此外，基于在同一动物的血流中仅发现肿瘤中产生的所需蛋白质的 0.2-0.3% 的发现，同时对小鼠进行疫苗接种并有效产生针对过量产生的蛋白质的抗体。因此，可以从同一只小鼠（或任何其他动物）收集血清，并将其用作小鼠衍生的抗体，以对抗过量产生的肿瘤蛋白或其他产物。

因此，本文提供通过向含有肿瘤的受试者施用微生物在非人类受试者中产生基因产物和/或抗体的方法，其中微生物具有选择用于产生的蛋白质或RNA、蛋白质或表达一种RNA，其表达可导致形成待产生的化合物或产生针对其产生抗体的选定蛋白质或RNA。本文提供的方法可进一步包括向具有表达编码待产生的选定蛋白质或RNA的外源基因的微生物的受试者施用其表达可导致形成产生肿瘤的化合物的蛋白质或RNA，或要产生抗体的选定蛋白质或 RNA。本文提供的方法可进一步包括向具有表达编码待产生的选定蛋白质或RNA的基因的微生物的受试者施用，其表达可导致形成待产生的化合物的蛋白质或RNA将产生包括瘤。或将针对其产生抗体的选择的蛋白质或RNA，其中所述基因表达可以例如通过转录激活剂或诱导剂或转录抑制因子来调节。本文提供的用于产生蛋白质、RNA、化合物或抗体的方法可以进一步包括通过检测可检测的蛋白质来监测对象中微生物的位置和/或数量，其中可检测的蛋白质可以指示所选择的微生物的表达。基因或可能指示微生物准备好被诱导表达所选基因或抑制、终止或暂停表达。本文还提供了通过向含有肿瘤的受试者施用微生物在非人类受试者中产生基因产物和/或抗体的方法，其中该微生物具有要产生的选定蛋白质或 RNA，蛋白质或 RNA 表达当施用微生物的对象是非转基因动物时，该表达可导致形成要产生的化合物或要产生针对其的抗体的选定蛋白质或RNA。本文还提供了通过向含有肿瘤的受试者施用微生物在非人类受试者中产生基因产物和/或抗体的方法，其中微生物表达选择要产生的蛋白质，其中选择受试者体内的肿瘤基于其翻译后处理所选蛋白质的能力。

该系统的优点包括：

(a) 没有必要生产携带编码多肽的新盒的转基因动物；

(b) 肿瘤系统比组织培养更有效；

(c) 破坏动物生长的蛋白质和其他有毒蛋白质可以在肿瘤中过量产生，而不会对宿主动物产生不利影响；

(d) 系统速度快：从cDNA克隆到蛋白质和抗血清纯化在4-6周内；

(e) 该系统相对便宜且易于扩展；

(f) 可以实现蛋白质的正确折叠和修饰；

(g) 可以获得高抗原性，有利于更好的抗体生产；是

(h) 可以在小鼠等动物中使用肿瘤作为发酵罐实现基于物种特异性细胞的蛋白质生产。

下文提供了用于产生基因产物和/或针对基因产物的抗体的示例性方法的概述。菲戈。 2个.

在一个实施方案中，提供了产生所需多肽、RNA或化合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)将含有编码所需多肽或RNA的核苷酸序列的微生物注射到携带肿瘤的动物中； (b) 从动物身上获取肿瘤组织； (c) 从肿瘤组织中分离所需的多肽、RNA 或化合物。

示例性方法的步骤可概括如下（针对特定实施例显示，即痘苗病毒另外含有编码发光蛋白的基因）：

(1)将目的DNA或cDNA插入痘苗病毒基因组；

(2) 构建发光蛋白作为表达标记，修饰痘苗病毒基因组；

(3) 病毒在细胞培养中的重组组装；

(4) 筛选含有单个病毒颗粒的插入片段，随后进行大规模病毒生产和浓缩；

(5) 将病毒颗粒施用于小鼠或其他患有人类、非人类灵长类动物或其他哺乳动物来源的肿瘤的动物；

(6) 评估动物体内的病毒复制和蛋白质过量生产作为光发射的函数；

(7) 提取肿瘤组织和任选的血液（分别）；是

(8) 使用标准方法从肿瘤中纯化过表达的蛋白质，并任选地从血液中纯化抗血清。

任何微生物都可以用于本文提供的方法，只要它在动物中复制，例如，对动物是非致病性的，是减毒的，并且被动物的免疫系统识别。在一些实施例中，所述微生物也可表达外来基因。合适的微生物和细胞描述于例如文献 EP A1 1 281 772 和 EP A1 1 281 767 中。本领域技术人员还知道如何产生携带所需肿瘤的动物（参见例如 EP A1 1 281 767 ).或 EP AI 1 281 777）。

还提供了一种同时生产所需多肽、RNA 或化合物和针对该多肽、RNA 或化合物的抗体的方法，该方法包括以下步骤：(a)施用含有编码所需多肽的核苷酸序列的微生物或携带肿瘤的动物中的 RNA； (b) 从动物身上获取肿瘤组织； (c) 从肿瘤组织中分离所需的多肽、RNA 或化合物； (d) 从动物血清中分离针对多肽、RNA 或化合物的抗体。这种方法可用于生成有毒、不稳定或需要物种特异性细胞环境才能正确折叠或修饰的多肽和/或多肽抗体。

在另一个实施方案中，微生物可以进一步包含编码可检测蛋白质的核苷酸序列，例如发光或荧光蛋白质，或能够诱导可检测信号的蛋白质。

通常，在微生物或细胞转染方法中，编码所需多肽或 RNA 的核苷酸序列和任选地编码可检测蛋白质的核苷酸序列，例如发光或荧光蛋白，或能够诱导可检测信号的蛋白质，核苷酸序列存在于载体或表达载体中。各种表达载体是本领域技术人员已知的，可以根据用于感染肿瘤的微生物、肿瘤细胞的类型、待感染的生物体以及本领域已知的其他因素来选择。在一些实施例中，微生物可以是病毒，包括本文所述的病毒。因此，核苷酸序列可以包含在含有适当表达盒的重组病毒中。适用于本文的病毒包括但不限于杆状病毒、牛痘病毒、新培斯病毒、仙台病毒、腺病毒、AAV 病毒或细小病毒如 MVM 或 H-1。载体也可以是逆转录病毒，例如 MoMULV、MoMuLV、HaMuSV、MuMTV、RSV 或 GaLV。例如，为了在哺乳动物细胞中表达，合适的启动子是人巨细胞病毒立即早期启动子(pCMV)。此外，可以使用组织和/或器官特异性启动子。例如，核苷酸序列可以可操作地连接到允许高水平表达的启动子。这样的启动子可以包括，例如，诱导型启动子；多种此类启动子是本领域技术人员已知的。

为了产生编码蛋白质或RNA的核苷酸序列并构建包含该核苷酸序列的表达载体或病毒，可以使用本领域已知的一般方法。此类方法包括例如本领域已知的体外重组技术、合成方法和体内重组方法，并在 Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory 中举例说明. Press, Cold Spring Harbor, New York 使用含有蛋白质编码 DNA 或 RNA 的载体转染细胞、转染细胞的表型选择、转染子的表型选择和核苷酸序列表达的方法是本领域已知的。

在一些实施方案中，待在肿瘤中产生的蛋白质或RNA可与诱导型启动子连接，例如可由受试者内源性物质或可施用于受试者的物质诱导的启动子。因此，本文提供了在肿瘤中产生蛋白质或 RNA 的方法，其产生可以通过向受试者施用物质和任选地收获肿瘤并从肿瘤中分离蛋白质或 RNA 来诱导。所述诱导方法可以与用于监测个体中的微生物的方法组合。例如，可以通过检测可检测的蛋白质来控制微生物。在涉及监测、检测受试者体内所需位置和/或数量的微生物的方法中，可以与微生物基因表达的诱导相协调。例如，如果在肿瘤中检测到可检测的微生物表达的蛋白质，但在正常器官或组织中检测不到，则可以对受试者施用诱导剂。在另一个例子中，如果在肿瘤和正常器官或组织中都检测到可检测的微生物表达的蛋白质，则可以停止或延迟给予诱导剂，直到在正常器官或组织中不再检测到可检测的蛋白质。在另一个例子中，如果在肿瘤中检测到足量的可检测的微生物表达的蛋白质，则可以向受试者施用诱导剂。在另一个实例中，如果在肿瘤中未检测到足够量的可检测微生物表达的蛋白质，则可以停止或延迟给予诱导剂，直到在肿瘤中检测到足够量的可检测蛋白质。

本文还提供了通过施用编码蛋白质或RNA和基因表达抑制因子的微生物在肿瘤中产生蛋白质或RNA的方法。可以将基因表达抑制剂施用预定的时间段，或者直到微生物在肿瘤中积累但不在正常器官或组织中积累，或者直到足够量的微生物在肿瘤中积累，此时可以使用抑制剂管理的。中断或暂停，这可能导致蛋白质或 RNA 表达。如本领域技术人员所理解的，也可以使用与本文提供的关于监测可检测蛋白质和施用诱导物以终止或中断抑制物施用的方法类似的方法。

在一个实施方案中，微生物是细菌，例如减毒细菌，如本文提供的那些。示例性细菌包括减毒的鼠伤寒沙门氏菌, 静音霍乱弧菌, 静音李斯特菌o大肠杆菌.或者，可以在本文提供的方法中使用诸如痘苗病毒、AAV、逆转录病毒的病毒。在示例性方法中，病毒是痘苗病毒。可用于本方法的其他细胞包括哺乳动物细胞，例如。 B.肌瘤细胞，包括人体细胞等。 B. 人类纤维细胞。

可以使用多种动物，包括实验室动物或家畜，包括例如小鼠、大鼠和其他啮齿动物、兔子、豚鼠、猪、绵羊、山羊、牛和马。动物的例子是老鼠。肿瘤可以通过将肿瘤细胞植入动物体内而产生。通常，任何类型的实体瘤都可用于生产所需的多肽、RNA 或化合物，例如。 B. 一种快速生长的肿瘤。快速生长的肿瘤类型的例子是 C6 小鼠神经胶质瘤和 HCT116 人结肠癌。通常，可以使用生长相对缓慢的肿瘤类型来产生所需的抗体。生长缓慢的肿瘤类型的例子包括 HT1080 人类纤维肉瘤和 GI-101A 人类乳腺癌。对于不依赖于 T 的抗体生产，可以使用异种移植物或携带同种异体肿瘤的 nu-/nu- 小鼠；而对于 T 依赖性抗体的生产，可以使用具有同基因肿瘤的免疫活性小鼠。在一些实施例中，例如，当要产生的化合物是蛋白质时，所选择的微生物可以是使用肿瘤细胞的翻译成分（例如，蛋白质、囊泡、底物）的微生物，例如使用翻译成分的病毒.的肿瘤细胞。在这种情况下，可以根据需要对蛋白质进行的翻译后加工来选择肿瘤细胞类型，包括蛋白水解、糖基化、脂酰化、二硫化物形成，以及可能需要细胞成分才能完成的任何多聚体或再折叠组装。 .在一些例子中，所选择的肿瘤细胞类型可能与待表达的蛋白质属于同一物种，从而导致蛋白质的物种特异性翻译后加工；由示例性肿瘤细胞类型表达的一种类型的蛋白质是人类的。

1. 重组蛋白和 RNA 分子的生产

肿瘤组织可以通过手术从动物身上移除。肿瘤组织匀浆后，可以根据已建立的方法纯化所需的多肽、RNA 或其他生物化合物。例如，在重组多肽的情况下，多肽可以包含可结合的标签，例如His标签，并且可以例如通过柱层析纯化。在动物的肿瘤中积累足够量的多肽或RNA所需的时间取决于许多因素，例如，动物的种类或肿瘤的类型，并且可以由本领域技术人员使用常规实验来确定. .通常，可在病毒注射后两天检测到所需多肽的表达。表达在注射后约两周达到峰值并持续长达两个月。在一些实施方案中，肿瘤中所需多肽或RNA的量可通过监测微生物表达的可检测物质来确定，其中可检测物质的水平可反映肿瘤中所需多肽或RNA的量。

在另一个实施方案中，可以在受试者中产生所需的多肽、RNA或其他化合物并赋予受试者有益的效果。在一个实例中，微生物可以编码产生不是由受试者产生的化合物的蛋白质或RNA或蛋白质。在一个实例中，微生物可以编码肽激素或细胞因子，例如胰岛素，其可以释放到缺乏产生胰岛素的能力或需要脉管系统中升高的胰岛素水平的受试者的脉管系统中。在另一个例子中，凝血因子可以在具有凝血缺陷的个体中产生，例如血友病患者。在一些实施方案中，待在肿瘤中产生的蛋白质或RNA可与诱导型启动子连接，例如可由增加的葡萄糖水平诱导的启动子。在这种情况下，蛋白质或 RNA 的产生可能是对受试者体内的一种或多种物质的反应，或者是通过一种或多种可以施用于受试者的物质，例如。 B. 一种能够诱导转录的化合物，RU486。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法可包括向携带肿瘤的个体施用能够表达一种或多种编码有用基因产物的基因或能够产生有益化合物的基因产物的微生物。

2.抗体的产生

还提供了产生所需抗体的方法，该方法包括以下步骤： (a) 向携带肿瘤的动物施用含有编码抗原的核苷酸序列的微生物； (b) 从动物血清中分离出针对抗原的抗体。可以通过熟知的方法分离和纯化针对抗原的抗体。针对特定污染抗原（例如，细菌抗原）的抗体可以通过吸附去除，针对靶抗原的抗体可以通过亲和纯化（例如，亲和纯化）从污染抗体中纯化出来。 B.通过免疫亲和层析，使用重组抗原作为柱结合剂，通过本领域已知的方法分离。抗体可以一次性从动物身上收集，或者它们可以通过放血随时间收集，如本领域已知的那样。

F. 药物组合物、组合物和试剂盒

包含本文提供的微生物和一种或多种组分的药物组合物、组合和试剂盒在本文中提供。药物组合物可包含微生物和药物载体。组合可包括两种或更多种微生物、微生物和可检测化合物、微生物和调节微生物表达的化合物、微生物和治疗化合物。试剂盒可包含本文提供的药物组合物和/或组合以及一种或多种成分，例如使用说明书、用于检测受试者体内微生物的装置、用于向受试者施用化合物的装置和用于向受试者施用化合物的装置。一个复合主题。

1.药物组合物

本文还提供了包含修饰的微生物和合适的药物载体的药物组合物。合适的药物载体的例子是本领域已知的并且包括磷酸盐缓冲盐水、水、乳剂例如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。这样的载体可以通过常规方法配制并以合适的剂量施用于受试者。可用于微生物递送的胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、颗粒和基于脂质的系统，包括水包油（混合）乳液、胶束、脂质体和脂质复合物。示例性胶体系统是脂质体。器官特异性或细胞特异性脂质体可用于实现仅向所需组织的递送。脂质体的靶向可由本领域技术人员使用众所周知的方法完成。这种靶向包括被动靶向（利用脂质体扩散到含有窦毛细血管的器官中的 ER 细胞的自然趋势）或主动靶向（例如，将脂质体偶联到特定配体，例如抗体）、受体、糖、糖脂、蛋白质等通过众所周知的方法）。在本方法中，单克隆抗体可用于通过特定细胞表面配体将脂质体靶向特定组织，例如B.待治疗的肿瘤组织。

2.宿主细胞

本文还提供了包含本文提供的微生物的宿主细胞，例如微生物。 B. 改良的痘苗病毒。这些宿主细胞可以包括多种哺乳动物、鸟类和昆虫细胞以及对微生物如痘苗病毒感染敏感的组织，包括鸡、兔、仓鼠和猴胚胎肾细胞，例如B. CV-1、BSC40、Vero、BSC40 和 BSC-1 以及人类 HeLa 细胞。转化这些宿主细胞的方法、转化体的表型选择等是本领域已知的。

3.组合

组合可包括微生物和一种或多种成分。本文的任何组合还可以包含药物组合物和/或含有微生物和一种或多种组分的宿主细胞而不是微生物。

组合的实例可包含两种或更多种微生物、微生物和可检测化合物、微生物和微生物表达调节化合物或微生物和治疗化合物。例如，包含两种或更多种微生物的组合可以包含两种或更多种微生物，其可以施用于执行本文提供的方法的受试者，包括两种微生物的顺序施用。在一个实例中，组合可包括病毒和细菌，例如，可先将病毒施用于受试者，然后可将细菌施用于受试者。

本文提供的组合可包含微生物和可检测化合物。可检测化合物可包括配体或底物或其他化合物，其可与微生物表达的蛋白质或 RNA 分子特异性相互作用和/或结合并提供可检测信号，例如可通过层析成像、光谱或共振技术确定的信号.可以证明。可检测化合物的实例可以是或包括显像剂，例如磁共振、超声或层析显像剂，包括放射性核素。可检测化合物可以包括本文别处提供的或本领域已知的多种化合物中的任何一种。通常，在本文提供的组合中包含在微生物中的可检测化合物是作为底物、配体或能够与微生物编码的蛋白质或RNA特异性相互作用的化合物；在一些实例中，蛋白质或RNA是外源蛋白质或RNA。可检测的微生物/化合物的例子包括荧光素酶/荧光素编码微生物、β-半乳糖苷酶/(4,7,10-三(乙酸)-1-(2-β-吡喃半乳糖基乙氧基)-1,4,7,10 -四氮杂环十二烷）、钆（Egad）和本领域已知的其他组合。

本文提供的组合可包含微生物和调节微生物基因表达的化合物。调节基因表达的化合物是本领域已知的并且包括但不限于转录激活剂、诱导剂、转录抑制因子、RNA聚合酶抑制剂和RNA结合化合物例如siRNA或核酶。本领域已知的多种基因表达调节化合物中的任何一种都可以包括在本文提供的组合中。通常，在本文提供的组合中包含在微生物中的基因表达调节化合物是可以结合、抑制或与一种或多种在微生物的基因表达中具有活性的化合物（例如转录因子或RNA）反应的化合物。组合。 .示例性微生物/表达调节剂可以是编码嵌合转录因子复合物的微生物，该复合物具有融合到酵母GAL4 DNA结合结构域的突变人孕酮受体，来自单纯疱疹的病毒VP16蛋白的激活结构域，并且还含有合成启动子一系列包含主要腺病毒 E1B 的 TATA 盒上游的 GAL4 识别序列，其中连接点可能是 RU486（参见，例如，Yu 等人，Mol Genet Genomics 2002 268：169-178）。本领域已知的多种其他微生物/表达调节剂组合也可以包括在本文提供的组合中。

本文提供的组合可包含微生物和治疗化合物。治疗性化合物可以包括作为微生物表达的酶的底物的化合物、可以杀死或抑制微生物生长或毒性的化合物、或本文提供的或本领域已知的与微生物联合作用的其他治疗性化合物。通常，在本文提供的组合中与微生物一起包含的治疗化合物将是能够与微生物联合作用的化合物，例如微生物编码的酶的底物，或已知对微生物具有活性的抗微生物剂。微生物。微生物的组合。微生物/治疗化合物组合的例子可以包括编码单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦的微生物，和化脓性链球菌/青霉素。本文提供的或本领域已知的多种已知组合中的任一种可包括在本文提供的组合中。

4.设备

试剂盒组合包装，任选包括其他试剂或试剂盒或使用说明。本文提供的任何试剂盒还可以包含药物组合物、含有微生物的宿主细胞和/或一种或多种组分的组合，而不是微生物。

示例试剂盒可包括本文提供的微生物，并且可任选地包括一种或多种组分，例如使用说明书、用于检测受试者体内微生物的装置、用于向受试者递送化合物的装置和用于将化合物给药至受试者的装置。课程

在一个示例中，套件可以包括说明书。说明书通常包括描述微生物的有形语言和任选地包括在试剂盒和施用方法中的其他组分，包括用于确定受试者的适当状况的方法、适当的剂量水平和用于管理微生物的适当施用方法。 .说明书还可以包括在治疗期间监测受试者的指南。

在另一个例子中，试剂盒可以包括用于检测受试者体内微生物的装置。用于检测对象中的微生物的装置可以包括用于检测例如由荧光素酶发出的光或由绿色荧光蛋白发出的荧光的微光成像装置、MRI测量装置，例如成像装置磁共振成像或MRI、扫描断层扫描设备，例如 PET、CT、CAT、SPECT 或其他相关扫描仪、超声机或其他可用于检测受试者体内微生物表达的蛋白质的设备。通常，试剂盒装置能够检测试剂盒微生物表达的一种或多种蛋白质。本文提供的试剂盒中可包含多种包含微生物和检测装置的试剂盒，例如表达荧光素酶的微生物和弱光成像仪，或表达绿色荧光蛋白的微生物和图像发生器。

本文提供的试剂盒还可包括用于将微生物递送给受试者的装置。本领域已知的多种药物或疫苗递送装置可包括在本文提供的试剂盒中。装置的实例包括皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射器、吸入器和液体分配器如移液管。通常，试剂盒中用于递送微生物的装置与试剂盒中的微生物相容；例如，高压注射器等无针注射器可能包含在带有未被高压注射破坏的生物体的试剂盒中，但通常不包含在带有被高压注射破坏的生物体的试剂盒中。

本文提供的试剂盒还可以包括用于将化合物给予受试者的装置。本领域已知的用于向受试者给药的多种装置可以包括在本文提供的试剂盒中。装置的例子包括皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射器、吸入器和流体分配器。通常，试剂盒中的化合物递送装置与所需的化合物递送方法相容。例如，皮下给药的化合物可以包含在皮下注射针头和注射器套件中。

G. 例子

以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。

示例 1

重组病毒的产生

一种野生型痘苗病毒 (VV) 株 LIVP（已知的病毒株最初是通过减毒从俄罗斯莫斯科病毒制备研究所的 ATCC Lister 株登录号 VR-1549 获得的；参见 A1（Tshtein 等人， (1983) Doc Akad Nauk, USSR 285:696-699) 设计为 VGL 用作构建重组病毒的起始病毒，在本文中称为 RVGLX 所有痘苗病毒均使用蔗糖梯度 (Yoklik) 进行分离使用 CV-1 细胞（ATCC No. CCL-70）通过噬菌斑测定确定滴度。构建重组痘苗病毒的方法是本领域技术人员已知的（参见，例如，Chakrabarti 等人，（1985 Mol. Cell. Biol. 5:3403 and US Patent No. 4,722,848) 表 1 总结了本实施例中描述的重组 VV 菌株。

PUV 处理使 VV 失活

LIVP VV (3×10^8个pfu/ml) 与 1 µg/ml 补骨脂素（Calbiochem，La Jolla，CA）一起孵育，在室温下悬浮于 Hank 缓冲液中 10 分钟，然后在 Stratalinker 1800 UV 交联剂单元（Stratagene，La Jolla，CA）中悬浮 5 分钟.). ),配备5个365 nm长波紫外灯产生PUV-VV。

RVGL8：在 LIVP 的 F3 中插入​​ LacZ

包含插入 NotI 位点的 lacZ 基因的 RVGL8 重组痘苗病毒构建体如 Timiryasova 等人所述构建。 (2001) 生物技术 31, 534-540。简而言之，它是按如下方式完成的。来自 pSC65 的 BamHI/SmaI 片段 (3293 bp)（参见 Chakrabarti 等人 (1997) BioTechniques 23, 1094-1097；另请参见 Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing 和 Wiley-Interscience Supplement 15:16.17.2 (1992)也参见本文的 SEQ ID NO: 5 和 PCT 国际申请号 WO 99/32646 中的 SEQ ID NO: 57)，它们将 lacZ 基因置于痘苗病毒 p7.5 启动子和强合成痘苗病毒 pE/L El 的控制之下。通过限制酶消化分离含有启动子的启动子，用 Klenow 酶淬灭并克隆到质粒 pNT8 的 SmaI 位点（Timiryasova 等人（2001）BioTechniques 31：534-540）以产生 pNZ2a 穿梭以产生质粒。

为了构建 pNT8，使用以下引物扩增野生型 VV 菌株 LIVP 的 NotI 区域：

目标：5'-GGGAATTCTTATACATCCTGTTCTATC-3'（SEQ ID NO：3）；

Reverso: 5'-CCAAGCTTATGAGGAGTATTGCGGGGCTAC-3' (SED ID NO: 4)

以 VV 为模型。所得的 972 bp 片段分别在 5' 和 3' 端包含侧翼 EcoRI 和 HindIII 位点。 PCR 产物用 EcoRI 和 HindIII 消化并插入 pUC28（Benes 等人，（1993）Gene 130：151）。 :

pUC28I：5'AATTCAGATCTCTCCATGGATCGATGAGCT 3'（SEQ ID NO：6）；

pUC28 II：3'GTCTAGAGGTACCTAGCTAC 5'（SEQ ID NO：7）进入 pUC18 的 EcoRI 和 SstI 位点。这将 BglII、ClaI 和 NcoI 位点引入到 pUC18 多接头中。

pNZ2 质粒含有编码大肠杆菌在痘苗病毒 p7.5 早期/晚期启动子和源自质粒 pSC65 的合成痘苗病毒 pE/L 早期/晚期启动子控制下的 lacZ 基因（参见 Chakrabarti 等人 (1997) BioTechniques 23, 1094-1097，也参见 Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing 和 Wiley-Interscience Supplement 15:16.17.2 (1992)，也参见此处的 SEQ ID NO: 5 和 PCT 国际申请号 WO 99/32646 中的 SEQ ID NO: 57。质粒 pNZ2 在 VGL 病毒 (ATCC VR-1549) 的 NotI 位点提供 lacZ 的同源重组，以产生命名为 RVGL8 的重组痘苗病毒。将 NotI 消化的野生型痘苗病毒 DNA 和未消化的 pNZ2 质粒 DNA 的复合物转染到 PUV-VV 感染的细胞中进行体内重组以产生 RVGL8（参见菲戈。 1个). RVGL8 和本文所述的其他重组痘苗病毒列于下表 1 中。

突变病毒的产生/转染

非洲绿猴肾成纤维细胞 CV-1 (ATCC #CCL-70) 在 60 毫米培养皿（康宁，纽约州康宁，美国）中生长，用 PUV-VV（具有补骨脂素和紫外线的 LIVP 菌株）处理 J. Virol 70, 165 -171 Timiryasova 等人 (2001) BioTechniques 31 534-540 Timiryasova 等人 (2001) J Gene 3 Med. 3, 468-477) 关于 1 的感染复数 (MOI)。

感染两小时后，用 NotI 消化的病毒 DNA (4 µg) 和完整质粒 DNA (4 µg) 的混合物转染细胞。根据制造商的说明，每 µg DNA 使用 5 µl GenePORTER 试剂（Gene Therapy Systems，San Diego，California，USA）进行脂质介导的细胞转染。细胞在转染混合物中孵育 4 小时，然后补充含有 20% 胎牛血清的培养基。每天通过光学显微镜监测细胞病变效应。将细胞孵育 5-7 天，直至形成病毒斑块和完全的细胞病变效应。然后收获感染的细胞，重悬于0.5ml培养基中，冻融3次以释放病毒。选择单个病毒斑块用于生产小型和大型重组病毒原种，并分析基因插入和表达。

确认突变体

通过 Southern 印迹分析病毒 DNA。简而言之，为了分离病毒 DNA，将在 10 cm 培养皿中生长的汇合单层 CV-1 细胞用野生型 VV（菌株 LIVP）或来自单个重组板的病毒原液 VV 进行感染。当细胞病变效应完成时，收集细胞并将沉淀重悬于 3 ml 10 mM Tris-HCl，pH 9.0 中。裂解病毒颗粒，用蛋白酶 K 处理，然后通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀分离病毒 DNA。将 DNA 重悬于 100 µl 无菌水中。病毒 DNA 样品在 37°C 下用 NotI 消化过夜，然后进行苯酚-氯仿处理，沉淀并通过 0.8% 琼脂糖凝胶分离 10 µg DNA 样品。将 DNA 转移到带正电荷的尼龙膜（罗氏诊断公司，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国）并使用 GS 基因接头（Bio-Rad 实验室，赫拉克勒斯，加利福尼亚州，美国）固定到膜上。.)。使用非放射性 DNA 检测和标记试剂盒（Roche Diagnostics Corporation）进行 DNA 的 DIG 标记，并在 37°C 下孵育 60 分钟。该膜与 3357 bp NotI-NotI DNA 片段杂交，该片段用 DIG 标记的质粒 pNZ2 标记，pNZ2 编码 lacZ 基因。按照制造商的建议进行杂交和印迹显影条件。

预测条带大小为 3357 bp。 NotI 消化的病毒 DNA 与 3357 bp DNA 探针的杂交证实了 lacZ 基因整合到病毒基因组的 NotI 位点。

具有单个TK基因突变的RVGL2和RVGL23病毒的构建

LIVP 痘苗病毒用于构建 RVGL2 重组病毒。牛痘西储 (WR) 病毒用于构建 RVGL23 重组病毒。的cDNA我是驯鹿荧光素和春分GFP 融合（ruc-gfp；1788 bp；参见 Wang 等人，（1996）Bioluminescence Chemiluminescence 9：419-422；Wang 等人，（2002）Mol.Genet.Genomics 268：160-168；Wang 等人。 (1997) pp. 419-422 in Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons, Hastings et al., eds., Wiley, Chicheser UK, also see US patent. gfp(RG) 描述于 Wang et al., (1996)生物发光化学发光 9:419-422 和 Wang 等人，(2002) Mol.热内特。 Genomics 268: 160-168 及其后，通过 PmeI 限制性核酸内切酶插入到质粒 pSC65 的 SmaI 位点（参见 SEQ ID NO: 5；也参见此处和 PCT 国际申请号 WO 99/32646 中的 SEQ ID NO: 57 ). ), 产生质粒 pSC65-RG-1 的 DNA。

简而言之，为了制作 pcDNA-ruc-gfp，编码修饰的 EcoRI-NotI 片段我是驯鹿荧光素酶终止子 DNA（参见 Wang 等人（1997）pp. 419-422 in Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons, Hastings et al. eds., Wiley, Chicheser UK）被插入载体 pcDNA3.1 (Invitrogen , Carlsbad, California), 将术语 des我是驯鹿在 CMV 启动子控制下的荧光素酶。末端的终止密码子我是驯鹿去除荧光素酶 ORF，并用 NotI 消化所得质粒。包含人源化 ORF 编码的 NotI 片段春分GFP（Zolotukhin 等人，（1996）J.Virol。70:4646-4654) 从 pTR-β-肌动蛋白质粒中切下并插入编码它的质粒的 NotI 位点。我是驯鹿荧光素酶。所得质粒命名为 pcDNA-ruc-the-ruc-gfp。

新质粒 pSC65-RG-1 包含在痘苗病毒 PE/L 启动子控制下的 ruc-gfp 融合体和大肠杆菌在 VV p7.5 启动子控制下的 β-半乳糖苷酶用于构建被来自 LIVP 株的 RVGL2 基因和来自 WR 株的 RVGL23 中断的单一 TK 病毒。 CV-1 细胞用 LIVP wt 或 WR wt 病毒以 0.1 的 MOI 感染，两小时后使用 FuGene6 转染试剂（Roche）转染转染的质粒 pSC65-RG-1 DNA。孵育24小时后，将细胞冻融3次释放病毒。在存在底物 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal, Stratagene, Cedar Creek, Texas, USA) 的情况下，在 CV 细胞中选择重组病毒。经过四轮病毒纯化，所有病毒噬菌斑的β-半乳糖苷酶表达均呈阳性。分别通过发光测定和荧光显微镜证实了 ruc-gfp 融合蛋白的表达。病毒的示意图显示在菲戈。 1个.

具有单基因突变的RVGL5和RVGL9病毒的构建

重组痘苗病毒 RVGL5 包含在痘苗 p11 晚期启动子控制下的 lacZ 基因，该启动子插入到痘苗基因组的 HA 基因中（Timiryasova 等人（1993）Mol Biol 27：392-402；也参见 Timiryasova 等人，（ 1992) Oncol 研究 11:133-144.)。重组痘苗病毒 RVGL9 融合了我是驯鹿荧光素酶 (ruc) 和绿色荧光蛋白 (GFP) 基因 cDNA 在插入 VV 基因组 F3 基因的牛痘合成早期/晚期 (PE/L) 启动子的控制下（Timiryasova 等人，（2000））pp. 457-459，第 11 届生物发光和化学发光国际研讨会论文集，Case 等人，编辑）。 RVGP5 和 RVGLP9 的构建如 RVGLP2 和 RVGLP23 所述。

TK和F3基因双突变RVGL20病毒的构建

通过 BamHI 从质粒 pCDTRi（ATCC 登录号 59324 和 59325）中分离出具有 polyA 序列的人转铁蛋白受体（hTR）cDNA（2800 bp），用 Klenow 处理，并插入质粒 pSC65（此处为 SEQ ID NO：5）的 SalI 位点和 PCT 国际申请号 WO 99/32646 中的 SEQ ID NO：57），产生 pSC-TfR 和 pSC-rTfR。质粒 pSC-rTfR 含有与牛痘 PE/L 启动子方向相反的 hTR cDNA，并且大肠杆菌β-半乳糖苷酶在牛痘 p7.5 早期/晚期启动子的控制下，两侧是牛痘序列，用于插入牛痘 TK 基因。 pSC-rTfR 用于构建 RVGL20 病毒。 RVGL9，一种在 F3 基因座上携带 ruc-gfp 融合的单一缺失重组病毒，包含 LIVP 菌株特有的 NotI 位点（见上文，另见 Timiryasova 等人，（2000）第 457-459 页，in的程序11^º生物发光和化学发光国际研讨会, Case et al., eds.) 作为起始病毒，用于通过如上所述的同源重组产生 RVGL20 病毒。下面是RVGL20病毒的示意图菲戈。 1个.

在 TK、F3 和 HA 基因中具有三重突变的 RVGL21 病毒的构建

β-葡萄糖醛酸酶 (gus) cDNA大肠杆菌(1879 bp) 从质粒 pLacGus（Invitrogen；参见此处的 SEQ ID NO:9）和 XbaI（平端与 Klenow 片段）和 HindIII 中释放，并转移到质粒 pSC11 pSC65（Chakrabarti 等人（1985）Mol. Cell Biol .5:3403-3409，此处的 SEQ ID NO:5 和 PCT 国际申请号 WO 99/32646 中的 SEQ ID NO:57），在来自牛痘的晚期启动子的控制下用 XhoI（Klenow 处理的）和 HindIII 消化p11 产生 pSC-GUS 质粒。将来自质粒 pSC-GUS 的 SmaI-HindIII 片段插入到质粒 pVY6 中，质粒 pVY6 是一种用于将抗原基因插入牛痘血凝素基因的载体（参见，例如，Flexner 等人，(1988) Nature 355:259-262 Flexner 等人., (1988) Virology 166:339-349，也参见美国专利号 5,718,902）用 SmaI 和 BamHI 消化，产生质粒 pVY-GUS。得到的质粒，称为质粒 pVY-GUS，包含在痘苗病毒 p11 晚期启动子的控制下编码 Gus 的 cDNA，两侧是痘苗病毒序列，用于插入血凝素 (HA) 基因。以双缺失重组RVGL20病毒为起始病毒构建RVGL21病毒。 CV-1 细胞以 0.1 的 MOI 感染 RVGL20 病毒。感染后两小时，使用 FuGene6 转染试剂 (Roche)，用 pVY-GUS 质粒 DNA 切割细胞。在添加底物 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-GlcA)-β-glucuronidase (Research Products Int. Co. , Mt. Prospect, Illinois, USA）在琼脂培养基上。在存在 X-GlcA 的琼脂培养基上进行八次纯化后，选择了纯重组病毒 RVGL21。 RVGL21 病毒在 TK、F3 和 HA 基因上有改变，如图 1 所示。菲戈。 1个.

体外病毒观察

CV-1、C6 (ATCC # CCL-107)、B16-F10 (ATCC # CRL-6475) 和 GI-101A（Rumbaugh-Goodwin Institute for Cancer Research Inc. Plantation, Florida；美国专利 5,693 (0.533) 细胞以 1×10 的密度接种于 24 孔板中^5个, 2×10^5个, 4×10^5个, 英里 2 × 10^5个细胞/孔。第二天，细胞与 LIVP 野生型及其突变体的 0.001 或 0.01 PFU/细胞共感染。将病毒悬浮液添加到细胞单层（0.15 ml/孔）中，并在 37 °C 下孵育 1 小时，每 10 分钟短暂摇动一次。然后去除病毒，加入适当的完全生长培养基（1mL/孔），然后在病毒感染后将细胞在37℃下孵育24、48、72和96小时。为建立静止细胞培养物，将融合的单层 CV-1 细胞在含 5% FBS 的 DMEM 培养基中于 37°C 孵育 6 天。这些静止细胞在与上述相同的感染后时间点被感染和收获。来自受感染细胞的病毒通过冻融循环释放。通过对 CV-1 细胞的噬菌斑测定一式两份地测定病毒滴度并表示为 PFU/ml。

表 1

重组痘苗病毒 (VV) 列表

前部

插入位置/

指定

指定

描述

庞

参考

VER

重量

LIVP线

不

公开可用

vv

打电话

RVGL1

recVV2

(p7.5) 吕克-

印地语III-N-

蒂米里亚索娃 TM,

(p11) LacZ de

打乱

Kopylova-Sviridova TN,

LIVP VV

Fodor I.Mol。生物

（俄语）27:392-401

(1993);

蒂米里亚索娃 TM，李杰，

Chen B. Chong D.

Langridge WHR, Gridley DS,

Fodor I. Oncol。解决

11: 133-144 (1999)

RVGL5

recVV8

(p11) LacZ de

和-

蒂米里亚索娃 TM,

LIVP VV

打乱

Kopylova-Sviridova TN,

Fodor I.Mol。生物

（俄语）27:392-401

(1993)

RVGL7

rVV-EGFP

(PE/L) EGFP-

TK-

Umphress S, Timiryasova T.,

o

(p7.5) LacZ 冯

打乱

荒川 T. Hilliker S.

rVV-GFP

LIVP VV

Fodor I., Langridge W.

来自变性人 4:19-33

(2003)

RVGL8

rVV 无 LacZ

(p7.5) LacZ 冯

诺伊 (F3)-

蒂米里亚索娃 TM,

o

LIVP VV

打乱

陈 B., 福多 N.,

rVV 没有 LZ

福多一世

生物技术的

31: 534-540 (2001)

RVGL9

rVV-RG

(市盈率/升)

诺伊 (F3)-

Timiryasova TM, 于亚,

o

Ruc-GFP de

打乱

Shabahang S,

rVV-ruc-gfp

LIVP VV

Fodor I，Szalay AA。

的程序

11^º国际的

座谈会

生物发光

化学发光

S.457-460 (2000)

RVGL12

相同的

rvgl7,

除了那个

HSV TK es

插入

当地gfp

RVGL19

(市盈率/升)

TK-e

这里

Trf-(p7.5)

诺伊 (F3)-

LacZem Tk

打乱

本地 (PE/L)

Ruc-GFP em

F3-Ort of 的

LIVP VV

RVGL20

(市盈率/升)

Tk-e

这里

rTrf-(p7.5)

诺伊 (F3)-

LacZem TK

打乱

本地 (PE/L)

Ruc-GFP em

F3-Ort of 的

LIVP V

RVGL21

(市盈率/升)

Tk-, HA-

这里

rTrf-(p7.5)

打乱

LacZem TK

而不是我

场所，（第 11 页）

(F3)-

HA 中的 LacZ

打乱

本地, (PE/L)

Ruc-GFP em

F3-Ort of 的

LIVP VV

RVGL23

(市盈率/升)

Tk-

这里

rTrf-(p7.5)

打乱

LacZem TK

西铁位置

vv

示例 2

病毒水平的体外分析

紫芝

重组痘苗病毒诱导的 lacZ 表达分析如前所述进行（Timiryasova 等人 (2001) BioTechniques 31, 534-540）。简而言之，用 10 倍稀释的病毒原种感染 6 孔板（康宁，纽约州康宁，美国）中生长的 CV-1 细胞。病毒在 37°C 下吸收 1 小时，偶尔摇动。然后，用含有1％琼脂的完全培养基代替病毒接种物并孵育48小时。为了可视化病毒斑块，将每毫升 300 µg X-Gal（分子探针，尤金，美国）和 0.1% 中性红（Sigma，圣路易斯，密苏里州，美国）添加到第二个琼脂覆盖层和平板中被计算在内。并在 37°C 孵育 12 小时后分离。还可以通过测量细胞中的噬菌斑形成单位 (PFU) 来确定体外细胞中的痘苗病毒水平。

由斑块形成单位测量的体外 VV 感染性

LIVP-wt 病毒及其突变体感染和复制的能力在分裂和静止的 CV-1 细胞以及三种肿瘤细胞系（C6、GI-101A、B16-F10）中进行了测试。结果表明，MOI 为 0.001 的牛痘突变体可以有效地感染和复制正在分裂的 CV-1 细胞。从 CV-1 细胞的分裂中获得了大量的痘苗病毒。 VV wt 及其突变体在分裂 CV-1 细胞中的产量比静止 CV-1 细胞高约 10 倍。痘苗病毒突变体和体外野生型病毒研究之间的病毒回收率没有显着差异。 TK、F3 和 HA 基因的破坏对 VV 突变体在分裂的 CV-1 细胞中的复制没有影响。测试了三个肿瘤细胞。在 0.001 的 MOI 下细胞病变效应的相对敏感性如下：CV-1（分裂，最高），CV-1（静止），C6，GI-101A，B16-F10（最低）。 MOI 为 0.001 时，小鼠 B16-F10 黑色素瘤细胞不易受病毒感染。在 MOI 为 0.01 时，从受感染的黑色素瘤细胞中回收到非常低的病毒滴度。还观察到，与 LIVP 株相比，WR wt 株能够在体外更有效地感染黑素瘤细胞，并且与 LIVP 株相比，病毒产量更高。

示例 3

动物模型和试验

动物模型

6-8 周龄的无胸腺裸鼠 (nu/nu) 和 C57BL/6 小鼠（Harlan Animal Res., Inc., Wilmington, MA）用于动物研究。五只或四只一组的小鼠静脉注射。与 10⁷VV PFU，体积为 0.1 ml i.v.分别用低光成像仪和荧光成像仪对小鼠进行 ruc 和 gfp 表达成像。该研究事先获得了 LAB Research International Inc.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）动物研究委员会的批准。所有动物护理均在 LAB Research International Inc.（美国加利福尼亚州圣地亚哥）许可的兽医监督下进行。

胶质瘤模型

为了建立皮下胶质瘤肿瘤，通过胰蛋白酶消化和 5x10^5个将细胞/0.1ml/小鼠皮下(s.c.)注射到6-8周龄雄性无胸腺小鼠的右后爪中。 C6 细胞移植后第 7 天，肿瘤平均大小约为 150 毫米^3个, 病毒剂量为 10⁷PFU/0.1ml/小鼠静脉注射(i.v.)。注射病毒后 14 天处死小鼠。在 RVGL9 病毒的动力学研究中，小鼠在注射病毒后 20 分钟、1 小时、4 小时、18 小时、36 小时、3 天、5 天、7 天和 14 天处死。

乳腺肿瘤模型

皮下发育 (s.c)。乳腺肿瘤，GI-101-A 人乳腺癌细胞（Rumbaugh-Goodwin Institute for Cancer Research Inc. Plantation, Florida；美国专利号 5,693,533），剂量为 5 × 10^6个皮下注射细胞/0.1 ml/小鼠注入。在 6-8 周大的雌性无胸腺小鼠的右后爪上。 GI-101A细胞植入后第30天，平均肿瘤大小约为500毫米^3个, 病毒剂量为 10⁷PFU/小鼠静脉注射。注入。在病毒注射后第 14 天处死小鼠。用于生存实验和乳腺肿瘤治疗研究的小鼠被维持较长时间（病毒注射后大于 100 天）。小鼠长出约 4000 毫米的肿瘤^3个, 和/或体重下降 50% 的动物死亡。

黑色素瘤模型

对于黑色素瘤模型，B16-F10 小鼠黑色素瘤细胞（ATCC 编号 CRL-6475），剂量为 2 × 10^5个将细胞/0.04ml/小鼠注射到6-8周龄雄性C57BL/6小鼠的足垫中。肿瘤形成时（平均肿瘤大小约为 100 毫米^3个), 细胞植入后第 18 天，病毒剂量为 10⁷/鼠标静脉注射。注射病毒后 10 天处死小鼠。

动物模型中的痘苗病毒

从裸鼠肿瘤和器官中回收牛痘病毒

从处死的动物收集血液和器官（肺、肝、脾、肾、睾丸、卵巢、膀胱、脑、心脏），收集肿瘤并在含有蛋白酶抑制剂混合物的 PBS 中匀浆。在每个器官解剖或切口后更换剪刀和镊子以避免组织交叉污染。冷冻和解冻样品，以 1000 g 离心 5 分钟。在 CV-1 细胞的无血清培养基中稀释的上清液中，通过噬菌斑测定和孵育 48 小时后用 1% (w/vol) 结晶紫溶液染色来确定病毒滴度。每个样品一式两份测试，病毒滴度表示为平均 PFU/g 组织。

测试测量

生存研究在皮下注射的 6 周龄裸鼠中进行。人类乳腺肿瘤。小鼠静脉注射。与 10⁷来自痘苗病毒并经过加工以维持生存。每周测量两次个体体重。病毒感染后的体重增加/减少以百分比计算：注射病毒当天的体重（g）-肿瘤重量（g）/注射当天的体重（g）-肿瘤重量（g）-上涨 x 100%。取出处死动物的脾脏并称重。 RSW 计算如下： RSW = 脾脏重量 (g) × 10^4个/动物体重(g)-肿瘤重量(g)。当平均肿瘤体积达到 3,000 mm3 时处死小鼠。^3个或已出现疾病征兆。快速一氧化碳_2个安乐死是按照人道标准进行的。NIH 实验室动物护理和使用指南。

记者随笔

紫芝

大肠杆菌根据试剂盒制造商的说明，使用 Galacto-Light Plus™ 分析化学发光系统（Applied Biosystems，Bedford，MA，USA）测定小鼠组织和血清样品中的 β-半乳糖苷酶活性。简而言之，将 1-20 µl 样品转移到含有 200 µl 1:100 稀释的 Reaction Buffer Diluent 的试管中，并在室温下孵育 30 分钟。将 300 µl 等份的促进剂 (-II) 添加到装有样品的试管中，快速混合并在光度计中读取信号。 β-半乳糖苷酶活性以每克组织的相对光单位 (RLU) 表示。清理干净大肠杆菌β-半乳糖苷酶 (Sigma) 用作阳性对照并构建标准曲线。

萤光素

我是驯鹿如前所述（Yu 和 Szalay，2002）并进行一些修改，在组织样品用 Turner TD 20e 发光计（Turner Designs，Sunnyvale，CA，USA）均化后，在组织样品的上清液中测量荧光素酶活性。简而言之，将 20 µl 样品添加到 500 µl 含有腔肠素底物的荧光素酶测定缓冲液（0.5 M NaCl、1 mM EDTA、0.1 M 磷酸钾，pH 7.4）中。在 10 秒间隔期间测量荧光素酶活性并表示为每克组织的 RLU。

检测结果

随着时间的推移 RVGL9 的存在

具有单个 F3 基因突变和 ruc-gfp 载体的痘苗病毒 RVGL9 用于表征静脉注射后载体的组织分布模式。对接受皮下注射的免疫功能低下的裸鼠给药神经胶质瘤。使用这种重组病毒的组织分布数据证明了这种 VV 毒株的病毒分布和肿瘤靶向。通过基于 ruc 和 gfp 表达的小鼠中病毒复制的非侵入性成像进行动力学研究。每组 4 到 5 只动物小鼠 C6 神经胶质瘤注射 10⁷RVGL9 病毒通过尾静脉。在病毒注射后 20 分钟、1、4、18 和 36 小时、3、5 和 14 天处死动物。在 IV 给药后的任何时候都没有从大脑、膀胱或睾丸中回收到活的病毒颗粒。病毒注射。在注射病毒后的第一时间，从脾脏、心脏和肺部回收了一些病毒颗粒。感染后 18 小时，这些器官中的 RVGL9 病毒滴度下降。 18 小时后，心脏组织中没有发现病毒；在第 14 天从脾脏和肺中分别回收了大约 156.5 和 44 PFU/g 组织，而在病毒注射后 20 分钟分别回收了 3221.0 和 3521.9 PFU/g 组织。肝脏和肾脏中的病毒恢复模式与脾脏、心脏或肺部不同。病毒注射后不久，从肝脏中未回收到肾脏病毒和 174.9 PFU/g 病毒组织。这些器官中的病毒滴度在注射病毒后第 5 天增加，在注射病毒后第 14 天减少。病毒给药后 18 小时在肿瘤组织中检测到病毒（1.6 × 10^3个PFU/g 组织）并在观察期间显着增加（1.8 × 10^8个PFU/g 组织（第 7 天）。单次静脉注射后，肿瘤组织中的病毒会存在 60 多天。病毒注射。结果显示了这些牛痘突变体的肿瘤特异性复制。在肿瘤和器官中观察到病毒恢复与转基因表达之间存在相关性。基于 RVGL9 的病毒动力学数据，第 10 天或第 14 天分别用于黑色素瘤和神经胶质瘤模型以及乳腺肿瘤中不同痘苗突变体的组织分布研究。

胶质瘤肿瘤小鼠中存在多个 VV

研究痘苗病毒在接受皮下注射的免疫缺陷小鼠中的组织分布。胶质瘤肿瘤，静脉注射病毒注入。剂量为 1×10⁷植入 C6 小鼠神经胶质瘤细胞后第 7 天，PFU/0.1 ml/小鼠。注射病毒14天后处死小鼠，测定不同组织的病毒滴度。注射wt WR病毒的小鼠因病毒致病性而生病和死亡。因此，注射 WR 的小鼠在病毒注射后第 7 天处死。从所有测试的组织以及大脑中回收了野生型 LIVP 病毒。从注射 LIVP wt 的小鼠中回收的病毒颗粒量远低于 VV 的 WR wt 株。结果示于表1A。

表 1A

神经胶质瘤模型中裸鼠组织的病毒重建。^A

RVGL21

LIVP

RVGL2

RVGL5

RVGL9

RVGL20

TK-, F3-,

写字台^乙

RVGL23

重量

TK-

和-

F3-

TK-, F3-

和-

重量

传统知识，西红柿

脑

1,2 × 10^3个

1,4 × 10^3个

1,4 × 10⁷

1,9 × 10^6个

漂洗

6,1 × 10^2个

6,7 × 10^2个

1,6 × 10^2个

34,6

33.3

36,6

5,4 × 10^6个

7,9 × 10^2个

推力

2,9 × 10^3个

1,6 × 10^2个

1,4 × 10^4个

6,7 × 10^3个

2,4 × 10^3个

1,9 × 10^6个

2,1 × 10^3个

基础

1,9 × 10^2个

1,8 × 10^2个

1,0 × 10^3个

1,0 × 10^2个

1,7 × 10^2个

1,6 × 10^6个

1,8 × 10^3个

睾丸

5,8 × 10^4个

64,3

6,4 × 10^2个

7,5 × 10^2个

9,8 × 10^4个

1,7 × 10^3个

厌倦了

6,4 × 10^3个

2,9 × 10^3个

2,8 × 10^5个

1,2 × 10^3个

肝

3,4 × 10^4个

63,6

4,2 × 10^2个

33.6

96,6

30.8

7,1 × 10^3个

5,6 × 10^3个

赫兹

6,0 × 10^3个

1,4 × 10^5个

血清^C

6,0 × 10^2个

瘤

5,4 × 10⁷

1,5 × 10⁷

3,8 × 10⁷

2,9 × 10⁷

3,9 × 10⁷

1,9 × 10⁷

1,9 × 10^8个

3,7 × 10⁷

结果表明，与 LIVP-wt 毒株相比，在注射了 WR 毒株的小鼠大脑中回收的病毒多 10,000 倍。在病毒注射后第 7 天，从小鼠血清 (600 PFU/20 µl) 中回收野生型 WR 株病毒。在第 14 天注射 LIVP 突变体的小鼠血清中未回收病毒。第 7 天未分析 LIVP 血清重量水平。大约 1.9 × 10^6个与 1.4 × 10^3个注射了 TK 突变株 LIVP (RVGL2) 的小鼠的 PFU/g 组织。

VV-LIVP 菌株的所有其他突变体主要仅在肿瘤中发现，并且没有从注射双重或三重突变体的小鼠脑组织中回收病毒（表 1A）。与 LIVP wt 相比，从注射 WR 的小鼠肿瘤中回收了三倍多的病毒颗粒。 LIVP 菌株突变体肿瘤组织中的平均病毒恢复与 LIVP wt 相似，相当于 WR 菌株的 TK 突变体。

乳腺肿瘤小鼠存在多个 VV

皮下注射的免疫功能低下小鼠的组织分布数据GI-101A的人体乳房如表1B所示：

表 1B

在乳腺癌模型中从小鼠裸组织中恢复病毒。

RVGL21

LIVP

RVGL2

RVGL5

RVGL9

RVGL20

TK-, F3-,

写字台^乙

RVGL23

重量

TK-

和-

F3-

TK-, F3-

和-

重量

传统知识，西红柿

脑

7,2 × 10^6个

1,6 × 10^4个

漂洗

3,6 × 10^3个

38.3

27

3,3 × 10^2个

25,8

3,2 × 10⁷

2,8 × 10^5个

推力

8,6 × 10^3个

5,5 × 10^2个

29.1

1,6 × 10^3个

1,6 × 10^3个

1,0 × 10^3个

2,1 × 10^6个

3,7 × 10^3个

基础

5,5 × 10^3个

99,5

1,8 × 10^2个

1,6 × 10^6个

1,8 × 10^3个

卵巢

1,6 × 10^3个

8,0 × 10⁷

2,7 × 10⁷

厌倦了

3,9 × 10^3个

2,8 × 10^4个

1,2 × 10^3个

肝

1,2 × 10^4个

1,7 × 10^2个

5,2 × 10^2个

1,7 × 10^2个

1,0 × 10^2个

4,0 × 10^5个

4,8 × 10^5个

赫兹

1,4 × 10^2个

58.2

4,6 × 10^2个

6,3 × 10^4个

2,2 × 10^3个

血清^C

2,4 × 10^3个

瘤

8,6 × 10^8个

1,0 × 10⁹

2,5 × 10^8个

1,1 × 10⁹

5,6 × 10^8个

1,0 × 10⁹

2,9 × 10⁹

6,6 × 10^8个

从乳腺肿瘤组织中回收的病毒颗粒比从胶质瘤肿瘤组织中回收的病毒颗粒多大约 10 倍。从注射了 wt-LIVP 或其突变体的小鼠脑组织中未回收到病毒颗粒。 7.2×10^6个英里 1,6 × 10^4个PFU/g 是从注射了 WR VV 毒株的 wt WR 或 TK 病毒的小鼠脑组织中获得的（表 1B）。在处死小鼠的器官制备过程中，发现与所有其他小鼠组相比，注射了 WR 病毒的 wt WR 和 TK - 的小鼠的卵巢显着增大。对卵巢病毒回收的分析表明，卵巢中 wt WR 和 TK-WR 毒株的滴度很高，例如 8.0 × 10⁷英里 2,7 × 10⁷单位/克。约 1.6×10^3个从注射了 LIVP wt 病毒的小鼠的卵巢中回收了 PFU/g，但未从注射了 LIVP 毒株衍生突变体的小鼠的卵巢或大脑中回收到病毒颗粒（表 1B）。

携带黑色素瘤肿瘤的小鼠存在多个 VV

还检查了脚垫上具有黑色素瘤肿瘤的免疫活性小鼠中 VV 的组织分布。 BL/6 小鼠在植入 B16F10 黑色素瘤细胞后第 17 天静脉注射。以10的剂量注射病毒⁷PFU/小鼠通过尾静脉。由于注射 PBS 的对照组中肿瘤的巨大尺寸，在病毒注射后第 10 天处死了所有组的小鼠。结果如表1C所示：

表 1C

从黑色素瘤模型中的 C57BL/6 小鼠组织中回收病毒。

RVGL21

LIVP

RVGL2

RVGL5

RVGL9

RVGL20

TK-, F3-,

写字台^乙

RVGL23

重量

TK-

和-

F3-

TK-, F3-

和-

重量

传统知识，西红柿

瘤

5,4 × 10^6个

3,9 × 10^6个

3,7 × 10^5个

9,5 × 10^5个

2,5 × 10^5个

2,4 × 10^5个

9,9 × 10^6个

2,2 × 10^6个

围巾^米

^A3-5 只大鼠/组的病毒回收率平均为 UFP/g 组织。

^乙注射病毒后第 7 天处死小鼠。

^CUFP/20 微升表面

^丁注射病毒后第 9 天处死小鼠。

^米未从所有分析的组织中回收病毒。

从注射了病毒的免疫活性小鼠的肾脏、肺、脾脏、大脑、睾丸、膀胱、肝脏、心脏和血清中均未回收到病毒。到目前为止，该病毒只能从肿瘤组织中获得。与其他组相比，从注射了 wt-LIVP、TK-LIVP、wt-WR 和 TK-WR 的小鼠肿瘤中回收了大约 10 倍的病毒颗粒。

例子 4

通过重组痘苗病毒 RVGL7、RVGL9 和 RVGL21 减少植入裸鼠的人乳腺肿瘤

RVGL7 和 RVGL9

菲戈。 1个图 12 显示了用于这些实验的重组痘苗病毒的示意图。 RVGL7 的制备如 RVGL9 的制备所述。 RVGL7 包含编码 EGFP 和 lacZ 的核酸，并且包括插入到 TK 基因中的 pE/L 和 p7.5 调节区。

裸鼠肿瘤的发光和荧光成像

GI-101A 人乳腺癌细胞 (5 × 10^6个细胞/小鼠）皮下植入小鼠右大腿。 RVGL9 细胞植入 30 天后，病毒被表达融合的 NotI (F3) 杀死我是驯鹿荧光素酶和绿色荧光蛋白 (RVGL9 = rVV-RG = rVVruc-gfp) 以 1x10 的剂量通过尾静脉静脉注射⁷UFP/鼠标。病毒注射后九天，i。 h 细胞植入后 39 天，拍摄了 GFP 的荧光图像和荧光素酶表达的弱光图像，显示病毒繁殖。

通过 RVGL7 或 RVGL9 痘苗病毒减少植入裸鼠的人乳腺肿瘤

GI-101A 人乳腺癌细胞 (5 × 10^6个细胞/小鼠）皮下植入小鼠右大腿。小鼠静脉注射。 RVGL7=rVV-GFT=TK− 或 RVGL9-rVV-ruc-gfp=NotI (3) - 病毒已停止（1×10⁷细胞植入后第 30 天，PFU/小鼠（0.1 毫升）和 PBS 对照。图像是在 GI-101A 细胞植入后 65 天和病毒或 PBS 注射后 35 天获得的。结果显示，与注射 PBS 的小鼠肿瘤相比，注射 TK 或 NotI (F3) 杀死的痘苗病毒的小鼠肿瘤体积显着减少。

病毒给药后人乳腺肿瘤中的 GFP

GI-101A 人乳腺癌细胞 (5 × 10^6个细胞/小鼠）皮下植入小鼠右大腿。小鼠静脉注射。病毒 RVGL7=rVV-GFP=TK− 或 RVGL9=rVV-RG-rVV-ruc-gfp-NotI (F3) 被逮捕 (1 × 10⁷细胞植入后第 30 天，PFU/小鼠 0.1 ml）。数据显示 TK 注射小鼠肿瘤区域的 GFP 表达⁻或被 NotI (F3) 中断的痘苗病毒。在小鼠身体的其他部位未观察到 GFP 信号。结果还表明，早在通过尾静脉注射病毒后 48 小时，就可以看到 GFP 表达。在病毒注射后第 16 天，非常强的 GFP 信号对应于大约 1300-1620 mm 的肿瘤体积^3个对于被 TK− 或 NotI (F3) 阻止的病毒。在第 25 天（1218–1277 mm^3个对于被 TK− 或 NotI (F3) 和 32 (514–887 mm^3个对于由于肿瘤体积减少而被 TK- 或 NotI（各 F3）杀死的病毒。

乳腺肿瘤体积随时间的时间演变

GI-101A 乳腺癌细胞皮下植入 4-5 周龄无胸腺 (nu/nu) 雌性小鼠的右大腿，剂量为 5x10^6个细胞/小鼠。肿瘤植入后三十天，当肿瘤达到约500毫米时^3个按体积计，单剂量（1×10⁷PFU/小鼠在 0.1 ml) 的 RVGL7=rVV-GFP=TK- 或 RVGL9=rVV-RG=rVV-ruc-gfp=NotI (F3)- 静脉内施用改变的痘苗病毒或对照 PBS（a 通过尾静脉） .每周用卡尺测量两次肿瘤尺寸，体积计算为 (L x H x W)/2，其中 L、H 和 W 分别代表肿瘤的长度、宽度和高度，以 mm 表示.^3个.数据显示，在注射了 TK、NotI (F3) 杀死的痘苗病毒的小鼠中，肿瘤显着缩小（第 65 天时缩小 60-80%）。相比之下，注射 PBS 的小鼠体内的肿瘤生长非常迅速。

通过消光监测肿瘤消退。

GI-101A 皮下乳腺肿瘤在接受单次静脉注射治疗的免疫功能低下小鼠中减少了 100%。将 LIVP 注射到 LIVP 菌株的 ponderal、F3 单、TK 单和 F3 双、TK 突变体中。在用上述病毒处理的小鼠中观察到一些毒性。 TK、F3、HA基因三重缺失的RVGL21病毒对裸鼠无毒性；因此，该病毒被用于长期研究。三重突变体 RVGL21 病毒的高剂量和低剂量治疗之间的抗肿瘤活性和存活率差异不显着。在注射 RVGL21 的小鼠的肿瘤区域监测 GFP 表达。在小鼠身体的其他部位未观察到 GFP 信号。早在通过尾静脉注射病毒后 48 小时就可以看到 GFP 表达。在病毒注射后第 16 天，我们观察到非常强的 GFP 信号，对应于大约 1300-1620 mm 的肿瘤体积。^3个并在 25 天时减少 GFP 信号（1218-1277 mm^3个) y 32 (514-887 毫米^3个) 由于肿瘤体积减小。通过对小鼠的目视检查，肿瘤体积的减少也很明显。

例 5

降低痘苗病毒的毒性和毒力

通过监测小鼠体重和存活率降低痘苗病毒致病性

给予各种 s.c. 的无胸腺和免疫活性小鼠体重的百分比变化。静脉注射后的肿瘤学过病毒管理。以 10 μg 的剂量注射 wt LIVP 和 wt WR 以及一些突变体⁷pfu/小鼠通过尾静脉导致进行性牛痘病毒感染超过两周的观察期。攻击后一周，小鼠的尾巴和足部出现典型的水泡。随后的体重减轻，有时伴随着嘴巴周围的肿胀，在一些情况下导致小鼠死亡。在 VV wt WR 菌株的情况下，小鼠在静脉注射后第 7 天开始死亡。病毒注射。而接受重组 LIVP 病毒的小鼠体重增加或在相同的时间段内保持相同的体重。

神经胶质瘤模型裸鼠的体重。

剂量为 5 × 10 的大鼠神经胶质瘤 C6 细胞^5个/0.1 ml/小鼠皮下注射第 0 天植入裸鼠（5-6 岁雄性小鼠）的右大腿。静脉注射痘苗病毒。 （通过尾静脉）剂量为 1 × 10⁷第 7 天 PFU/0.1 ml/小鼠。动物每周称重两次。感染后第 14 天体重的增加/减少计算为百分比：体重 - 病毒注射当天的肿瘤重量 (g) / 体重 - 第 14 天的肿瘤重量 (g) x 100%。注射 VGL（牛痘野生型病毒，LIVP 株）和 RVGL5（HindIII-N-破坏型）会导致裸鼠中毒：小鼠体重持续下降。重组痘苗病毒 RVGL5（HA 改变）、RVGL7（TK 改变）、RVGL8（NotI（F3）改变）、RVGL19（双重改变，TK 和 NotI（F3））在裸鼠中的毒性较小：丢失后一些体重，感染后10天，小鼠体重开始增加。

注射 VV 野生型 WR 株的荷瘤裸鼠在注射病毒后第 7 天体重减轻了 31.9%。注射了 WR 株 TK 病毒的小鼠在注射病毒后第 14 天体重减轻了 22.4%，而注射了 WR 株 TK 病毒 VV LIVP 株的小鼠体重下降了 1.5%。所有注射了野生型 LIVP 菌株的小鼠都存活了至少 14 天（实验持续时间）。注射 VGL（wt VV，菌株 LIVP）的无肿瘤小鼠体重减轻了 11.23%。注射 VGL (wt VV) 或 RVGL1 (HindIII-N-disrupted) 的肿瘤小鼠体重分别减轻了 15.79% 和 10.18%。 LIVP 重量组的小鼠体重减轻了 15.8%，而 PBS 注射组的体重减轻了 9.4%。荷瘤小鼠，其中RVGL2 (TK-)、RVGL5 (HA-)、RVGL7 (TK-)、RVGL8 (F3-)、RVGL9 (F3-)、RVGL20 (TK-、F3-)、RVGL21 (TK-) , F3-, HA-) 在注射病毒后第 14 天仅分别减轻了 1.5%、0.4%、2.1%、5.0%、7.3%、2.4% 和 3.2% 的体重。注射双基因敲除病毒 RVGL19（TK- 和 F3-）的荷瘤小鼠的体重与第 0 天的体重相比增加了 0.73%。根据体重结果，单次破坏 HA 、TK、F3(NotI基因座)和痘苗病毒基因组中TK、F3(NotI基因座)基因的双重破坏降低了痘苗病毒LIVP株的毒力和毒性。

然而，注射WR wt VV株对裸鼠毒性极大，裸鼠在注射病毒后第7天死亡。 LIVP 菌株的野生型和突变型 VV 在裸鼠中的毒性较小。尽管注射不同 LIVP 毒株的裸鼠体重有所下降，但在感染后第 10 天后，小鼠体重开始增加。

无胸腺乳腺肿瘤模型小鼠的体重

皮下裸鼠体重变化静脉注射后的 GI-101A 人乳腺肿瘤痘苗病毒注射得到控制。注射了 wt WR 菌株的小鼠体重减轻了 25.6%，并因病毒毒性而死亡。尽管注射 LIVP wt 病毒的小鼠存活时间更长，但小鼠体重减轻了 26.4%。注射了 TK-WR 毒株的小鼠体重减轻了 17.8%，而注射了 TK-LIVP 病毒的小鼠体重增加了 1.9%。所有注射了 LIVP 菌株其他突变体的小鼠都很稳定；在这些小鼠中没有观察到与病毒相关的毒性。

免疫活性黑色素瘤模型小鼠的体重

我们检查了牛痘病毒对爪子上有 B16-F10 小鼠黑色素瘤的免疫活性 C57BL/6 小鼠的毒性。尽管所有组中的小鼠在整个实验过程中都存活下来，但与 wt LIVP 和重组菌株相比，wt WR 菌株在免疫活性小鼠中的毒性更大。注射 wt WR 菌株的小鼠在静脉注射后第 10 天体重减轻了约 11.4%。病毒注射，而注射 LIVP wt 菌株及其双重 (RVGL20) 和三重 (RVGL21) 突变体的小鼠体重分别仅减轻 2.2%、1.3% 和 0.6%，而注射 PBS 的小鼠体重减轻 7.1%老鼠。小鼠静脉注射同期，RVGL2 (TK-)、RVGL5 (HA-)、RVGL9 (F3-) 和 RVGL23 (TK-WR 株) 的体重继续增加。

乳腺肿瘤小鼠病毒感染后的长期存活率

为了研究不同突变对长期生存的影响，皮下注射小鼠。 GI-101A 人乳腺肿瘤剂量为 10⁷IV 病毒并观察病毒感染后的存活率。结果表明，存活率因注射的病毒而异。皮下注射裸鼠具有 wt WR 菌株的乳腺肿瘤（IV，1×10⁷/小鼠）导致 100% 死亡率：五只小鼠中有四只在第 9 天死亡，一只小鼠在注射病毒后第 11 天死亡。注射 LIVP 菌株的小鼠存活了 35 天。注射单一 RVGL9 (F3-) 突变病毒的小鼠出现毒性，25% 的小鼠在注射病毒后第 34 天死亡；然而，删除 LIVP 品系中的 F3 基因可将小鼠的存活时间延长至 57 天。注射 RVGL20 双突变病毒（F3-，TK-）的小鼠在注射病毒后第 34 天开始死亡，但比注射 F3 的小鼠存活时间更长。注射 RVGL20 病毒的小鼠在第 65 天达到 50% 的存活点，并显示出显着更长的存活时间，可达 116 天。 LIVP病毒单突变体TK病毒的致病性低于F3单突变体或F3双突变体TK病毒；注射 TK 病毒后第 80 天，所有小鼠均存活，14.3% 的小鼠存活 130 天。与其他小鼠组相比，所有注射了 TK、F3 和 HA 三重突变病毒 (RVGL21) 的小鼠都存活了 130 天（实验期）并且继续存活而没有病毒毒性迹象。

不同小鼠的脾肿大

C57BL/6 免疫活性小鼠

几组动物表现出肿大的脾脏；因此，计算了相对脾脏重量（RSW）。结果如表2所示：

台面 2

有和没有肿瘤的小鼠的相对脾脏重量 (RSW)。

老的

胶质瘤模型

模型克雷布斯

黑色素瘤模型

群组

没有/不是一点点

没有/不是一点点

C57BL/6 小鼠

既不是肿瘤也不是 PBS

43,6 ± 4,1^A

50,5 ± 11,2^丁

30,1 ± 2,8^克

半肿瘤，LIVP

67,2 ± 11,9

48,0 ± 13,1

68,1 ± 9,4

肿瘤，PBS

92,4 ± 7,4^乙

84,1 ± 14,6^米

106,0 ± 46,1^H

LIVP

98,2 ± 28,2^C

108,4 ± 39,4^F

148,4 ± 44,8^UE

RVGL2

96,0 ± 34,9

112,7 ± 15,6

51,9 ± 6,6

RVGL5

143,8 ± 20,5

169,6 ± 31,7

61,6 ± 2,9

RVGL9

73,9 ± 10,5

151,8 ± 27,9

63,3 ± 34,9

RVGL20

84,9 ± 6,6

159,9 ± 22,7

106,7 ± 36,0

RVGL21

114,4 ± 12,5

117,7 ± 15,3

63,0 ± 24,6

写字台

37,3 ± 3,5

57,9 ± 10,9

70,5 ± 1,8

RVGL23

46,9 ± 15,7

73,1 ± 19,3

97,0 ± 43,9

n = 4-8 只小鼠/组的平均值±标准差。

RSW = 脾重 (g) × 10^4个/(动物体重(g)-肿瘤重量(g))。

^Ap ≤ 02.02 对比除无肿瘤 LIVP、WR、RVGL23 以外的所有组

^乙p ≤ 0,039 对比 Samentumor-PBS、Samentumor-LIVP、RVGL5、WR、RVGL23

^Cp ≤ 0.046 对比除 PBS、RVGL2、RVGL20、RVGL21 以外的所有组

^丁p ≤ 0.006 对比所有组，除了无肿瘤 LIVP、PBS、WR、RVGL23

^米p ≤ 0,048 vs todos los grupos excepto PBS sin tumor, LIVP, RVGL2, WR, RVGL23

^Fp ≤ 0.045 对比除 PBS、RVGL2、RVGL21 以外的所有组

^克p ≤ 0,035 在 PBS、LIVP、RVGL20、WR、RVGL23 之前

^Hp ≤ 0.049 对比除无肿瘤 IVP、RVGL20、WR、RVGL23 以外的所有其他组

^UE与所有其他组相比，p ≤ 0.049。

如上表2所示，在小鼠中观察到一定程度的脾肿大。在免疫活性 C57BL/6 小鼠中，与无肿瘤小鼠相比，注射 PBS、LIVP、RVGL20、WR 和 RVG123 的荷瘤小鼠存在统计学显着差异 (p<0.035)。在注射了 VV wt 菌株的小鼠中，LIVP 脾脏相对于所有其他组大大增大 (p<0.049)。相反，在无肿瘤小鼠中发现了最小的脾脏。

胶质瘤肿瘤裸鼠

在有或没有 s.c. 的裸鼠中。注射了 wt WR 或 WR 病毒 TK- 的神经胶质瘤小鼠的 RSV 最低，分别为 37.3 和 46.9，这与注射 PBS 的无肿瘤小鼠的 RSV (43.6) 相似。分别在 RVGL5 (HA-) 和 RVGL21 (TK-、F3-、HA-) 组中观察到最高 RSW 143.8 和 114.4。在注射 wt L1VP、RVGL2、RVGL9、RVGL20 的小鼠组与注射 PBS 的组之间没有发现统计学显着差异。

乳腺肿瘤裸鼠

皮下患有人乳腺肿瘤的免疫受损小鼠中 RSW 的结果表明，与注射了 wt-WR 或 TK-WR 病毒的小鼠相比，注射了 wt-LIVP 及其突变体的所有小鼠都具有增大的脾脏 (p<0.045)。在注射了 HA 单一、F3 单一、F3 双和 LIVP 菌株的 TK 突变体的小鼠中发现了最大的脾脏。

使用 RVGL21 注射的其他结果

两只小鼠 #437 和 #458 在注射 RVGL21 后存活超过 190 天（107 和 4 × 10^5个或 i.v.) 没有疾病或病毒毒性的证据。

植入 GI-101A 细胞后第 30 天（肿瘤体积 = 594.9 mm^3个), 10⁷静脉内施用 RVGL21。注入。在鼠标 #437 中。病毒注射后第 101 天（sc 肿瘤大小 = 220.4 mm^3个) 在皮肤下的胸部区域观察到转移（硬组织）。肿瘤大小为 1223.6 mm^3个，在第 148 天消失。肿瘤并没有消失，它又长回来了，但是老鼠仍然没有转移。

老鼠 #458 有一个第一次 s.c.右后肢的肿瘤 (GI-101A)。当第一个肿瘤开始缩小时（RVGL21 病毒注射后第 29 天，肿瘤大小 = 1924.3 mm^3个），第二个同基因肿瘤是 s.c.在左后方。第二个肿瘤生长缓慢，达到1205.7毫米^3个并开始缩小。小鼠在注射病毒后第 127 天没有第一个肿瘤；第二个肿瘤的大小为 439.6 mm^3个.肿瘤继续缩小，细胞死亡。身体逐渐吸收任何剩余的宿主提供的肿瘤组织（例如，宿主来源的肿瘤骨骼血管）。因为这些遗骸不被认为是外来的，所以它们不会被免疫系统破坏。另一方面，肿瘤细胞早就消失了，被免疫系统和病毒杀死了。第二个同基因肿瘤的减少表明这只小鼠已经产生了针对肿瘤细胞的抗体。抗体导致第二个同基因肿瘤缩小。

例 6

使用微生物或细胞诱导生物体针对肿瘤的自身免疫。

该实施例表明，此处和优先权申请 EP 03 018 478.2 中涉及“在肿瘤组织中生产多肽、RNA 或其他化合物”的方法也可用于生产针对肿瘤组织的抗体。这些抗体确保携带肿瘤的生物体的自身免疫。此外，这些抗体可以被分离并用于治疗其他生物体的肿瘤。

提供了微生物（包括细胞）的方法和用途，其可包含编码所需多肽或 RNA 的 DNA，用于诱导生物体针对肿瘤的自身免疫。还提供了通过以下方式产生抗肿瘤抗体的方法：(a)注射微生物，例如。 B.在携带肿瘤的生物体中任选含有编码所需多肽或RNA的DNA序列的病毒或细胞，和(b)抗肿瘤抗体的分离。

该实施例进一步证明施用在肿瘤中积累的微生物，例如本文提供的三重突变痘苗病毒株，导致它们释放肿瘤抗原足够长的时间以允许宿主产生抗体。这通过 GI-101A 实体乳腺癌异种肿瘤及其在 nu/nu（T 细胞缺陷）小鼠中的转移的减少和消除来说明。

步骤 #1：选择 5 周大的雌性 Nu/Nu 小鼠，并将 GI-101A 细胞培养在补充有雌激素和孕激素的 RPMI1640 培养基中。达到汇合，收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤。细胞（5×10^6个每只小鼠的细胞）然后皮下注射到小鼠体内。每隔一天仔细监测肿瘤生长。

步骤 #2：在肿瘤生长的两个阶段（肿瘤大小为 400-600 mm 和肿瘤大小约为 1700 mm^3个) 纯化的痘苗病毒颗粒 (RVGL12) 通过尾静脉静脉注射给每只荷瘤小鼠。在 CV-1 细胞系中扩增菌落纯化病毒，并通过蔗糖梯度离心纯化细胞内病毒颗粒。两种浓度的病毒（10^6个ufp/100 μl 和 10⁷pfu/100 ul 重悬于 PBS 溶液）注射。通过可视化病毒介导的绿色荧光蛋白表达从外部监测病毒复制。通过用数显卡尺确定肿瘤体积来监测肿瘤发展。

痘苗病毒 RVGL12 + GCV（更昔洛韦）和 RVGL12（RVGL12 与 RVGL7 相同，只是编码 gfp 的核酸在 GI-101A 后被单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV TK；参见 SEQ ID NO：35 和 36）替换细胞植入 在细胞植入后 30 天注射第二次给药，指定为 RVGL12a。

步骤#3：病毒给药后，发现肿瘤最初继续生长到约 900 毫米的大小^3个（损失 400-600 毫米^3个在病毒注射时）和约 2400 毫米的尺寸^3个（约 1700 毫米^3个).然后生长速度稳定约6-8天。

步骤#4：大约在病毒注射后 14 天，肿瘤的体积开始迅速缩小。应用病毒 40 天后，所有接受治疗的动物都表现出大于 60% 的肿瘤消退。在病毒治疗后 65 天，许多动物的肿瘤完全消退。

步骤#5：一些动物在数周内完全没有肿瘤，体重也恢复正常。相对于第 13 天的最大体积，用 RVGL-12+GCV 治疗导致肿瘤大小减少 86.3%（病毒注射后第 52 天），用 RVGL-12 治疗导致肿瘤大小减少 84.5%（第 52 天） ) 与其峰值体积（第 13 天）相比。用 RVGL-12a 治疗导致肿瘤大小（第 89 天）从其峰值体积（第 12 天）减少 98.3%。用 PBS+GCV 进行对照处理后，平均肿瘤体积在 38 天后增加了 91.8%

步骤#6：确定免疫激活水平。获得了肿瘤消退动物的血清，并测定了针对外源蛋白（例如，绿色荧光蛋白）、痘苗病毒蛋白和 GI-101A 癌细胞蛋白的免疫效价。从以下来源获得的以下抗血清用于测试以下列出的样品。

测试：

1).小鼠细胞裂解物（对照）；

二）。纯化和变性的痘苗病毒颗粒；

3). GI-101A 肿瘤细胞裂解物；

4).纯化的绿色荧光蛋白；

5).纯化的荧光素酶蛋白；

6).纯化的 β-半乳糖苷酶蛋白。

反索罗：

他）。非肿瘤小鼠抗血清；

B). GI-101A-Maus-Tumor-Antisuero；

瓦）。静脉注射牛痘 14 天后的 GI-101A 肿瘤小鼠抗血清注射;

D).静脉注射牛痘 65 天后的 GI-101A 肿瘤小鼠抗血清注射;

是）。静脉注射牛痘 80 天后的无肿瘤小鼠抗血清（GI-101A 肿瘤清除后）注射。

结果表明，肿瘤特异性痘苗病毒在肿瘤内大量复制，导致肿瘤内产生肿瘤蛋白抗原和病毒蛋白。此外，痘苗病毒裂解受感染的肿瘤细胞，释放肿瘤细胞特异性抗原。这些抗原持续渗漏到体内导致小鼠体内针对外来细胞蛋白（肿瘤蛋白）、病毒蛋白和修饰的病毒编码蛋白产生非常高的抗体滴度（约 7 至 14 天）。新合成的抗肿瘤抗体和增加的巨噬细胞和嗜中性粒细胞计数通过脉管系统持续输送到肿瘤，为肿瘤内激活的免疫系统提供补充。然后，活跃的免疫系统杀死了肿瘤，包括病毒颗粒。这种伴随的外来抗原释放增加了抗体的产生，并且抗体持续返回到肿瘤中所含的蛋白质作为自身免疫疫苗系统，由痘苗病毒复制启动，随后是细胞裂解，蛋白质泄漏和增加的产生。抗体的产生.

例 7

通过在荷瘤小鼠中传递 lacZ 的痘苗病毒产生 β-半乳糖苷酶和抗-β-半乳糖苷酶

35 只 nu/nu 裸鼠（5 周龄，25 g，雄性）被用来证明具有不同基因组缺失的痘苗病毒（LIVP 株）的生物分布和肿瘤靶向。将小鼠分为 7 组，每组 5 只，如表 1 所示。

不。

团体

方向盘

植入性肿瘤

注射病毒

插入位点

1个

5个

没有任何

VER

wtLIVP

2个

5个

C6，sc 5 × 10^5个细胞

VER

wtLIVP

3个

5个

C6，sc 5 × 10^5个细胞

RVGL1

N-luc, lacZ

4个

5个

C6，sc 5 × 10^5个细胞

RVGL5

HA-lacZ

5个

5个

C6，sc 5 × 10^5个细胞

RVGL7

TK-egfp, lacZ

6个

5个

C6，sc 5 × 10^5个细胞

RVGL8

不I-lacZ

7

5个

C6，sc 5 × 10^5个细胞

RVGL19

TK-rTrf,

lacZ, NotI-RG

C6 神经胶质瘤在第 2-7 组皮下发展。肿瘤细胞植入后五天（5×10^5个细胞/小鼠），每只动物用 0.1 ml 病毒处理，感染复数（MOI）为 1×10⁷通过注射到尾静脉。注射病毒两周后，处死所有小鼠并采集血样。还从动物身上取出各种器官和肿瘤用于病毒滴度和 β-半乳糖苷酶分析。

根据制造商的说明，使用 Galacto-Light Plus 系统（Applied Biosystems）进行 β- 半乳糖苷酶分析，这是一种用于检测 β- 半乳糖苷酶的化学发光报告基因测定系统。

β-半乳糖苷酶表达测量

在注射野生型痘苗病毒（无报告基因和无β-半乳糖苷酶基因）的无瘤小鼠和荷瘤小鼠中，器官、血液和肿瘤样本均未检测到β-半乳糖苷酶表达。相比之下，感染了表达 β-半乳糖苷酶的病毒的小鼠的肿瘤中表达了高水平的 β-半乳糖苷酶。如表 3 所示，还在血液样本中检测到 β-半乳糖苷酶，但未从血液样本中回收病毒。

蒂施 3

痘苗病毒在肿瘤和血液中产生 β-半乳糖苷酶

荷瘤小鼠（病毒注射后第 14 天）

β-半乳糖原瘤

户撒。 b 总计

户撒。 b 总计

病毒

μg/mg 总计

β-gal 表面

奇卡/肿瘤

加仑/5ml

团体

注入

蛋白质

微克/毫升总蛋白

（微克）

蓝光（微克）

3个

RVGL1

1,59 ± 0,41

1,38 × 10⁻²± 1,09 × 10⁻²

489,84

4,00

4个

RVGL5

1,51 ± 0,37

1,16 × 10⁻²± 1,08 × 10⁻²

330,21

3.62

5个

RVGL7

1,35 ± 0,59

0,95 × 10⁻²± 1,47 × 10⁻²

616,60

1,83

6个

RVGL8

1,81 ± 0,42

0,86 × 10⁻²± 0,33 × 10⁻²

962,36

2.38

7

RVGL19

1,30 ± 0,44

0,26 × 10⁻²± 0,16 × 10⁻²

463,75

0,60

抗β-半乳糖苷酶抗体的产生

为了确定小鼠血液中存在的 β-半乳糖苷酶的量是否足以诱导抗体产生，从两只小鼠（第 5 组的#116 小鼠和第 6 组的#119 小鼠）收集血清并检查抗β。 -Western 分析中的半乳糖苷酶。 β-半乳糖苷酶来自大肠杆菌(Roche, 567, 779) 作为标准抗原，小鼠单克隆抗β-半乳糖苷酶大肠杆菌(Sigma, G6282) 用作阳性抗体对照。作为 β-半乳糖苷酶的额外来源，在 RVGL7 感染 24 小时后以 1 pfu/细胞的 MOI 从 CV-1 细胞获得总蛋白，并获得指定为 #143（RVGL7 处理）的小鼠肿瘤蛋白样品。）。

一式三份制备蛋白质样品，每组包含 β-半乳糖苷酶抗原对照、来自 RVGL7 感染的 CV-1 细胞的细胞裂解物和来自小鼠 #143 的肿瘤裂解物。通过 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离所有蛋白质样品，并使用 BioRad 半干转移系统转移到 NitroBind 硝化纤维素 (MSI) 膜上。使用 1:3000 小鼠单克隆抗β-半乳糖苷酶或从小鼠 #116 或 #119 收集的 1:3000 小鼠血清和 1:3000 山羊抗小鼠 IgG-HRP (BioRad) 进行免疫印迹。放大的 Opti-4CN 检测试剂盒 (BioRad) 用于检测。

结果表明，与商业标准小鼠抗 β-半乳糖苷酶相比，从小鼠 #116 和 #119 收集的血清具有相似的抗体水平，并表明荷瘤小鼠 #116 和 #119 产生了针对 β-半乳糖苷酶的抗体。

例 8

用于肿瘤治疗的哺乳动物细胞

如此处所示，某些细菌、病毒和哺乳动物细胞 (BVMC) 在全身给药时选择性地重新进入肿瘤并在肿瘤中增殖。沙门氏菌、梭菌sp.,弧菌、大肠杆菌) 细胞进入实体瘤并在荷瘤生物体中复制。基因标记的细胞可用于肿瘤检测和治疗。除了通过靶向 BVMC 在肿瘤中表达基因外，还可以通过将转基因与组织/肿瘤特异性启动子连接来实现肿瘤特异性基因表达。可以采用多种系统靶向方案来获得肿瘤特异性基因表达。这些策略包括使用组织/肿瘤特异性启动子，使基因表达仅在特定器官中被激活，例如针对前列腺特异性启动子的 B. 病毒基因表达；使用靶向细胞外基质（即胶原蛋白）的病毒载体；以及使用抗体驱动的病毒载体。条件复制病毒也被用作标记基因或治疗基因的肿瘤特异性递送载体，例如。 B. 溶瘤腺病毒、复制选择性 HSV、牛痘病毒和其他类似病毒的载体颗粒。

当由发光蛋白编码的 BVMCs 被全身注射到啮齿动物体内时，肿瘤特异性标记基因的表达得以实现，并根据发光实时检测。因此，揭示了动物体内先前未知的原发性肿瘤和转移灶的位置。因此，诊断可以与治疗和治疗随访相结合。肿瘤中受损的淋巴系统可能解释了宿主免疫监视未能在细菌逃离脉管系统后清除肿瘤中的细菌。

例 9

然后抑制肿瘤的发展。S. Piogenes行政

这个例子和下面的例子展示了使用细菌细胞来定殖肿瘤，使用细胞指示剂来量化定植；使用定植的减毒细菌细胞抑制肿瘤。同时或依次施用细菌和病毒。在细菌之前施用病毒会增加肿瘤的细菌定植。施用表达酶的细菌，该酶可激活前药以靶向定殖细胞。

菌株

化脓性链球菌M 型 1 T 型 1（ATCC 目录号 700294）用含有细菌荧光素酶表达盒（G.R. Lamberton、M.J. Pereau、K. Illes、J. Kelly、J. Chrisler、Childers B. J.、 Oberg K C, Szalay A A. 2002. 生物发光的结构和表征化脓性链球菌.第 12 届生物发光和化学发光国际研讨会论文集，Case JF、Herring PJ、Robison BH、Haddock SHD、Kricka LJ、Stanley PE（编）。奇切斯特：威利，pp. 85-88。荧光素酶可以在外源性癸醛存在的情况下被检测到。

转变化脓性链球菌细菌在 BH1 培养基中在 20 µg/ml 氯霉素存在下于 37 °C 下过夜生长。过夜生长后，细菌在 OD 中计数₆₀₀并将细菌以注射指示的密度重悬于BH1培养基中。

肿瘤的生长和细菌的注入。

对 20 只 5 周大的小鼠在右侧大腿进行皮下注射。每只小鼠注射 5x10^5个用 pLEIN 衍生的逆转录病毒转化的 C6 神经胶质瘤细胞（Clontech；另见 WO 03/14380）。皮下肿瘤在细菌注射前植入后 7 天发展。

对于细菌注射，荷瘤小鼠用异氟醚麻醉。通过手术暴露的股静脉用装有 29½ 号针头的 1 ml 胰岛素注射器静脉内注射悬浮液。注射后，缝合切口。

使用数显卡尺在细菌注射后每周两次监测肿瘤生长。此外，在最后时刻拍摄了动物的荧光图像和摄影图像。通过给动物静脉内注射 30 µl 癸醛来分析发光细菌的存在。细菌荧光素酶活性的整体动物分析遵循类似于 Yu 等人的方法。 (2004)天然生物技术22(3):313-20。简而言之，将麻醉动物置于暗箱中进行光子计数（ARGUS100 低光成像仪，Hamamatsu）。在动物的腹侧和背侧收集光子 1 分钟，并使用 Image Pro Plus 3.1 软件（Media Cyber​​netics）和/或 Ligtools® 宏观成像系统记录图像。还拍下了一张绝美的照片。将发光图像叠加在光图像上以定位动物体内的发光活动。局部区域的光子发射总强度，例如在肿瘤区域，也被记录下来。化脓性链球菌从切除的肿瘤中分离出来，并将地面组织铺在 LB-氯霉素 (20 µg/ml) 板上。在存在癸醛蒸气的情况下对发光细菌进行计数。

结果

测试了四组小鼠。每组包含五只小鼠。

团体

S. Piogenes

1个

没有任何

2个

1×10^6个

3个

1×10⁷

4个

5 × 10⁷

在肿瘤发展和注射 7 天后测量肿瘤体积。化脓性链球菌，肿瘤发展后长达 21 天。

对照组小鼠未化脓性链球菌在 2 周的时间里，他们的肿瘤生长持续加速。小鼠注射化脓性链球菌肿瘤生长较慢。第 3 组和第 4 组的肿瘤生长速度最慢。两组在整个监测期间都保持较慢的线性速率，而未注射细菌的对照组显示肿瘤生长在随后的时期加速。

在细菌注射后的所有时间点，第 3 组和第 4 组小鼠的肿瘤体积均小于对照小鼠（第 1 组）。在第 21 天，对照组的平均肿瘤体积大约是第 3 组和第 4 组的平均肿瘤体积的 2.5 到 3 倍。注射细菌滴度最低的第 2 组的肿瘤体积也小于对照组尽管肿瘤体积大于第 3 组和第 4 组，但在较晚的时间点。

还将在纤维肉瘤模型中评估细菌定植和肿瘤抑制。将 pLEIN 逆转录病毒转化的 HT1080 纤维肉瘤细胞皮下注射到 5 周龄 5 × 10 雄性裸鼠的右侧大腿中。^5个细胞/小鼠）。化脓性链球菌在肿瘤生长 8 天或 14 天后（每天 5 只动物），将用 pDC123-luxF 转化的细胞注射到动物的股静脉中。一组5只动物不注射作为对照组。在随后的时间点监测肿瘤生长和荧光素酶活性。化脓性链球菌它从肿瘤中分离出来并在 BH1 平板 + 氯霉素 (20 μg/ml) 中培养。在存在癸醛蒸气的情况下对发光细菌菌落进行计数。

例 10

霍乱弧菌肿瘤定位

质粒和细菌菌株

坚定的霍乱弧菌，菌株 Bengal 2 血清型 0139，M010 DattRS1，用含有 luxCDABE 盒的 pLITE201 转化（Voisey 等人（1998）生物技术的24:56-58）。由于荧光素酶基因的表达，转化菌株是发光菌株。

肿瘤的生长和细菌的注入。

成组的裸鼠（n>20）转化为 C6 胶质瘤肿瘤（500 mm^3个)，如此处示例中所述。 1×10^8个转化细菌（霍乱弧菌) 悬浮在 100 µl 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中。将细菌悬浮液注射到每只小鼠的右后爪中。然后在注射后如实施例3中所述在弱光成像仪下监测动物。

在一个单独的实验中，裸鼠组 (n>20) 用 C6 神经胶质瘤肿瘤 (500 mm^3个)，如此处示例中所述。这些小鼠被注射 1x10^8个rVV-RUC-GFP (RVGL9) 病毒 pfu/小鼠（见实施例 1）。

结果

荧光素酶滴度和活性

来自两个注射组中每一个的小鼠在注射后时间点处死。切除肿瘤并匀浆。如本文实施例中所述测量细菌和病毒滴度以及萤光素酶活性。

注射后细菌和病毒滴度增加。随着时间的推移，细菌生长的增加与肿瘤中的荧光素酶水平成正比。注射小鼠肿瘤中细菌滴度与荧光素酶活性的对数图。霍乱弧菌表明细菌滴度和荧光素酶活性之间存在线性关系。注射 rVV-RUC-GFP 病毒的小鼠组也显示出病毒滴度和荧光素酶活性之间的线性关系。

时间之后霍乱弧菌/ pLITE注射

4个小时

8小时

16小时

32小时

细菌滴度

3,79 × 10^4个± 2,93

3,14 × 10^6个± 2,45

1,08 × 10^8个± 1,3

5,97 × 10^8个± 4,26

（UFC/肿瘤）

rVV-ruc-gfp 病毒注射后的时间

36小时

行程 3

旅行 5

7

病毒标题

3,26 × 10^6个± 3,86

7,22 × 10⁷± 3,67

1,17 × 10^8个± 0,76

3,77 × 10^8个± 1,95

(pfu/肿瘤)

实验表明滴度和荧光素酶活性之间存在线性关系。因此，注射的细菌和/或病毒的荧光素酶活性可以用作相关滴度测量。

地点

的位置霍乱弧菌如本文针对病毒的实施例中所述进行。简而言之，器官和血液样本是从用 CO 安乐死的动物身上分离出来的_2个气体。将器官切碎并接种在琼脂平板上，选择活性物质氯霉素用于细菌滴度分析。

在注射小鼠的肿瘤、肝脏、睾丸、脾脏、肾脏、肺、心脏、膀胱和大脑中测试细菌效价。样本取自在零时间处死的小鼠，然后在 150 小时后处死。霍乱弧菌注射。

注射后立即 (t=0)霍乱弧菌存在于所有样品中，在肝脏和脾脏中浓度最高。注射后长达 50 小时，滴度霍乱弧菌在除肿瘤组织外的所有组织中均降低。不像，霍乱弧菌该股自零时以来上涨了约 4 个数量级。该水平略有增加，然后在实验的其余部分保持不变。感染后 150 小时，除肿瘤外，所有样本的滴度均下降。例如，肝脏滴度从时间零开始下降了大约 5 个数量级。在 150 小时时，霍乱弧菌肿瘤组织中的滴度比任何其他组织样本高约 6 个数量级。

例 11

细菌和病毒的同时给药和顺序给药

霍乱弧菌/pLITE(见实施例10)和RVGL2痘苗病毒(见实施例1)一起或依次施用。如下表所示，对携带 C6 胶质瘤肿瘤的裸鼠组注射细菌和/或病毒。每组注射三只雄性小鼠。在肿瘤植入后第 11 天和第 16 天注射细菌和/或病毒。如本文实施例中所述监测肿瘤生长、荧光素酶和GFP活性。

团体

11天注射

16天注射

1个

1×10⁷VV-TK⁻-gfp-lacZ

1×10⁷霍乱弧菌/pLITE

2个

没有任何

1×10⁷霍乱弧菌/pLITE

3个

1×10⁷霍乱弧菌/pLITE

1×10⁷VV-TK⁻-gfp-lacZ

4个

没有任何

1×10⁷VV-TK⁻-gfp-lacZ

5个

没有任何

1×10⁷VV-TK⁻-gfp-lacZ e

1×10⁷霍乱弧菌/pLITE

结果

在第 21 天（肿瘤植入后 21 天）处死动物。每只动物的肿瘤都被切除并磨碎。在第 3、4 和 5 组中分析病毒效价。在第 1、2 和 5 组中测定细菌效价。效价（菌落形成单位和空斑形成单位）如前文实施例中所述进行。

肿瘤组1、2、5的细菌滴度比较显示，第1天及以后首次注射痘苗病毒的组1细菌滴度最高。霍乱弧菌第 16 天注射。第 16 天（第 5 组）细菌和病毒的共注射产生中间细菌滴度。第 2 组，仅注射霍乱弧菌到第 16 天，它在肿瘤组织中的细菌滴度低于第 1 组或第 5 组。因此，当第一次用 VV-TK 定植时，肿瘤更容易受到细菌定植。⁻-gfp-lacZ-病毒。

比较3、4、5组病毒滴度可知，第16天仅注射1次病毒的第4组病毒滴度最高，其次是第5、3组。第5组病毒滴度略高于第3组。 3，但显然没有显着差异。与第 4 组中其他 2 只小鼠的病毒滴度相比，第 4 组中的一只小鼠的病毒滴度极端异常。当在没有这只小鼠的情况下重新测试这些数字时，总体趋势保持不变。第 4 组的平均病毒滴度更接近第 3 组和第 5 组的病毒滴度。该分析中三组的数据没有显着差异。因此，与单独施用病毒相比，先施用细菌然后施用病毒并没有显着改变肿瘤的病​​毒定植。

例 12

通过施用表达 PNP 的细菌和前药抑制肿瘤 pSOD-DeoD 质粒含有细菌嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP) 基因（Sorcher 等人 (1994) GeneTher. 1(4):223-238） SOD 启动子（超氧化物歧化酶）。质粒 pSOD-DeoD-lux 包含 luxCDABE 表达盒（Voisey 等人（1998）生物技术的24:56-58) 插入 pSOD-DeoD。

PNP 将无毒的前药 6-甲基嘌呤脱氧核糖 (6-MPDR) 转化为 6-甲基嘌呤，从而抑制 DNA 复制、转录和翻译（Sorcher 等人 (1994)基因热。1(4):223-238)。

抑制肿瘤生长

给裸鼠注射用 pLEIN 逆转录病毒转化的 C6 神经胶质瘤细胞。 pLEIN 逆转录病毒在病毒 LTR 启动子的控制下表达 EGFP（Clontech；也参见 WO 03/14380）。大肠杆菌表达细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因的 DH5α 在肿瘤植入后第 8 天注射或不注射前药（6-甲基嘌呤脱氧核糖 (6-MPDR)）。在随后的时间点监测肿瘤体积（如在前面的实施例中所做的那样）。

团体

行政

1个

大肠杆菌/PNP + 前药

2个

大肠杆菌/即插即用

3个

大肠杆菌对照+前药

第 2 组和第 3 组在肿瘤植入后 8 至 21 天的时间点显示出相同的肿瘤生长。第 1 组，它同时收到大肠杆菌与对照组 2 和 3 相比，PNP 和前体药物的表达显示肿瘤大小在稍后时间点减少了约 20%。

为了进一步测试细菌定植和前药对肿瘤生长的影响，在裸鼠中选择了人类乳腺癌模型 GI-101A 腺癌。 GI-101A 源自 GI-101。 GI-101起源于 Rumbaugh-Goodwin 癌症研究所的研究人员在一名 57 岁患者中首次局部复发浸润性导管腺癌（IIIa 期，T3N2MX）。在皮下异种移植裸鼠模型中，肿瘤一直转移到肺部。与 C6 胶质瘤肿瘤模型相比，GI-101A 是一种生长较慢的肿瘤模型。

将 GI-101A 细胞皮下注射到 15 只 4 周大的雌性裸鼠的右侧大腿中。肿瘤形成三十天后注射细菌。大肠杆菌DH5α 用 pSOD-DeoD 或 pSOD-DeoD-lux 转化。细菌在含有 20 µg/ml 氯霉素的 LB 培养基中在 37 °C 下过夜生长。过夜生长后，细菌在 OD 中计数₆₀₀和细菌以指定密度重悬于 BH1 培养基中。用装有 29½ 号针头的 1 ml 胰岛素注射器通过外科手术打开的静脉或按其他指示将悬浮液静脉内注射到动物体内。注射后，缝合切口。

在注射细菌后每四天将前药施用于小鼠组。使用数显卡尺每周两次监测肿瘤生长。如本文实施例中所述进行萤光素酶成像。在终点，处死动物并如实施例9所述检查器官。进行组织学分析以确定由细菌定植和/或药物治疗引起的肿瘤坏死程度。

只要修改对本领域技术人员而言是显而易见的，本发明旨在仅受所附权利要求的范围限制。